Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

Заключение

                    Стимулом к изучению стволовых клеток человека служит то, что они таят в себе колоссальные возможности как с чисто научной точки зрения, так и в том, что касается их применения в клеточной терапии. Прежде всего речь идет о тех преимуществах, которые дает их использование при трансплантации. Если бы удалось получить стволовую клетку от взрослого индивида,  стимулировать ее деление и изменить специализацию.

    В тоже время следует найти способ индуцировать нужную спецификацию клеток. Одним из путей этой цели является трансфекция их различными ростовыми факторами под контролем подходящих промоторов. Удобной моделью для поиска таких промоторов служат гены флуоресцентных белков.

              Настоящая работа явилась первым этапом на пути отработки такой экспериментальной модели.

II. Материалы и методы.

1.Ферменты и реактивы.

В работе использовали ферменты, такие, как рестриктазы, РНКаза, фрагмент Кленова, фирм Fermentas и Promega Растворы и питательные среды готовили из реактивов высокой степени очистки производства фирм Gibco BRL, Fluka, Merck, Promega, Serva, Sigma, а также отечественных категории "о.с.ч.". Фенол и этиловый спирт перед использованием перегонял

2. Приготовление компетентных клеток.

Бактериальные клетки штамма XL 1-Blue растили на среде SOB (2 % триптон,  0,5 % дрожжевой экстракт, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl) в течение ночи. Полученной ночной культурой заражали 50 мл среды SOB и выращивали до плотности при 600 нм: 0,35-0,4 (Rec-) или 0,2-0,25 (Rec+). Потом клетки переносили в охлажденный центрифужный стакан и инкубировали клетки на льду не менее 15 мин. Затем клетки осаждали центрифугированием и тщательно удаляли супернатант. Ресуспендировали осадок в 15 мл раствора RF–1 (100 mM KCl, 50 mM MnCl2, 10 mM CaCl2, 30 mM CH3COO-K+ рН 7,5) и инкубировали суспензию в ледяной бане в течение 15 минут. Затем клетки осаждали центрифугированием и тщательно удаляли супернатант. Клетки суспендировали в 4 мл раствора RF 2 (100 mM MOPS рН = 6,8, 10 mM KCl, 75 mM CaCl2 , 15 % глицерин), разливали по эппендорфам и хранили в замороженном виде при -70˚С.

3.  Трансформация бактерий Е. Coli XL I-Blue плазмидами.

(Здесь и далее, кроме специально оговоренных случаев, протоколы заимствованы из Sambrook et al., 1989).

Компетентные клетки размораживали на льду. К 200 мкл клеток добавляли 2 мкл (1-50 нг) плазмидной ДНК, перемешивали и инкубировали на льду 30 мин. После этого клетки нагревали при 42°С в течение 45 сек, добавляли 1 мл среды Лоуренса-Бертани (LB) и ставили на шейкер на 1 час при 37°С. Клетки сеяли на чашки с селективной средой (100 мкг/мл ампициллина) и инкубировали 16-20 ч при 37°С. Выросшие одиночные колонии переносили в 10 мл среды  LB и растили 16-20 ч при 37°С на шейкере.

4. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

1.5 мл ночной культуры осаждали 5 мин на 5000 об/мин и ресуспендировали в 100 мкл буфера для лизиса клеток(50 мМ Трис, рН 7.0, 62.4 мМ ЭДТА, 0.4% Тритон Х-100 2.5 mM LiCl). Добавляли по 20-30 мкг лизоцима и разрушали клетки кипячением 2-3 мин. Охлаждали во льду и центрифугировали 10 мин на максимальных оборотах для очистки от бактериальных белков. ДНК из надосадочной жидкости очищали фенол-хлороформенной экстракцией или на колонках фирмы Amersham Biosciences.

5. Электрофорез в агарозном геле.

Для разделения фрагментов ДНК использовали агарозный гель(концентрация от 0.6% до 2 %) с добавлением бромистого этидия (10 мкг на 1 мл геля ). Электрофорез проводили в однократном буфере ТАЕ (0.04 М Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) при напряжении 1.5-2V на см2.

                                             6.   Рестрикция.

              Плазмидную ДНК обрабатывали  соответствующей рестриктазой фирмы Fermentas  и Promega согласно фирменным протоколами.

7. Контроль наличия вставки

(блот-гибридизация по Саузерну).

Хромосомную ДНК обрабатывали рестриктазой HindIII фирмы Fermentas (из расчета 1 единица фермента на 4 мкг ДНК) в буферном растворе фирменного производства при 37°С в течение 16-20

Для разделения фрагментов ДНК использовали 0.7% агарозный гель с добавлением бромистого этидия (10 мкг на 1 мл геля). Электрофорез проводили в однократном буфере ТАЕ (0.04 М Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) при напряжении 1.5-2 V

Для расщепления крупных фрагментов ДНК гель предварительно промывали в 0.25 М НС1 15-20 мин. Затем ДНК в геле денатурировали в растворе 1.5 М NaC1, 0.5 М NaOH 2 раза по 15 мин. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр Hybond N+ фирмы Amersham проводили в растворе 1. 5 М NaC1, 0.5 М NaOH. Фильтр запекали в вакуумной печи при 80°С.

Из конструкции Csp-hs-hNGF вырезали фрагмент по сайтам EcoRI / NotI и использовали его в качестве матрицы для синтеза радиоактивного зонда. Мечение ДНК изотопом фосфора  32 P, входящим в состав аденозинтрифосфата, проводили с помощью набора Random Prime Labelling фирмы Promega в соответствии с инструкциями производителя. Зонд переосаждали, добавляя к 25 мкл реакционной смеси 25 мкл воды, 20 мкл ДНК спермы лосося (10 мг/мл), 50 мкл 5 М ацетата аммония и тройной объем этанола, и растворяли в 100 мкл воды.

Предгибридизацию проводили в гибридизационном буфере (х4 SSPЕ, 1% SDS, х20 р-р Денхардта, 0.5мг/мл гепарина) в течение 1 ч при 65°С. Меченый зонд денатурировали 5 мин при 100°С и добавляли к гибридизационному буферу. Гибридизацию проводили 16-20 ч при 65°С в гибридизационной печи. Затем фильтр промывали 3 раза по 15 мин в буфере O.l SSC, 0.1% SDS, заворачивали в водонепроницаемую пластиковую пленку и закладывали в кассету с фотопленкой. Экспонировали при -70°С от 1 до 5 дней.

                   8.  Достраивание липких концов ДНК до тупых.

                    Реакцию достраивания липких концов до тупых («тупления»), проводили большим голоферментом ДНК-полимеразы I (фрагментом Кленова) из расчета 1 единица фермента на 1 мкг концов ДНК в буфере фирмы Fermentas, содержащим дНТФ в концентрации 20 пг., при 370 С          в течение 1 часа. Очистку реакционной смеси от несвязавшихся нуклеотидов проводили переосаждением в этиловом спирте.

                                 9.Лигирование.

Реакционную смесь составляли в соответствии с рекомендациями фирм изготовителей. Смесь инкубировали в течение ночи при Т= +40 С, далее ее трансформировали в компетентные клетки.

                                       10.Конструкции.

Генно-инженерные конструкции были синтезированы на основе вектора pcDNA3.1 для ввода в стволовые клетки.

Чтобы получить генно-инженерную конструкцию со встроенным геном красного флуоресцентного белка из плазмиды pDsRed-Exprees-№1 был вырезан фрагмент ВатI/NotI, содержащий ген RedЕxpress,  и встроен в сайты ВатI/NotI вектора pcDNA 3.1(+).

                                             III. Результаты

                    Целью данной работы было создание генно-инженерной конструкций, содержащих гены флуоресцентных белков  и использование их в качестве маркеров при трансплантациях и культивировании в стволовых клетках. Для этого была использована система флуоресцентных белков из морских кишечнополостных.

1.1.Использование  гена красного флуоресцентного белка  (pDsRed Exspress) в качестве маркера

                    Для  исследования возможности использования флуоресцентных белков в качестве маркера  и  дальнейшего  исследования в стволовых клетках человека была получена генно-инженерная конструкция на основании вектора pcDNA 3.1.+, несущая ген  pDsRed Exspress под цитомегаловирусным промотором человека (CMV)(Рис.1)

                  Для получения этой конструкции, из плазмиды p DsRed Exspress -N1 был    вырезан фрагмент  BamНI-Not I, содержащий ген pDsRed Exspress , и встроен в сайты  BamНI-Not I вектора pcDNA 3.1.+.Наличие вставки в этой конструкциии было проверено с помощью рестрикции по сайтам клонирования и электрофореза в агарозном геле (рис.2) Так же  контроль наличия вставки был осуществлен методом блот-гибридизации по Саузерну. Для этого равное количество ДНК (10 мкг), характеризующая наличия вставки (конструкции), чистую плазмиду pDsRed Exspress  и плазмиду вектора pcDNA 3.1.+, которую использовали в качестве отрицательного контроля, обрабатывали рестриктазой HindIII.Эта рестриктаза рестрицирует геномную ДНК. Далее рестрицированную ДНК разделяли электрофорезом в 0.8 % агарозном геле с последующей блот- гибридизацией с зондом, полученным на основе кДНК гена pDsRed Exspress  с использованием среднестатистических (случайных) праймеров. Для  блот-гибридизации было 4 дорожки  на первую была нанесена плазмида pDsRed Exspress, на вторую полученную конструкцию с определяемой вставкой pDsRed Exspress, на третью нанесен вектор pcDNA 3.1.+ , четвертая дорожка включала маркерную ДНК 1kb DNA Ladder.

                    В эксперименте не было обнаружено гибридизации на вектор pcDNA 3.1.+, которая являлась минус-контролем при исследовании и проверки наличия вставки в полученной конструкции. (Рис.3)

Полученной плазмидой были трансформированны бактериальные клетки штамма XL 1-Blue для нароста. После выделения и очистки эта конструкция была введена в культуру клеток мозга плода человека  методом электропорации. Клетки инкубировались в течение 2-х дней на селективной среде (с неомицином) до появления отдельных колоний. Клеточную культуру рассматривали в свете люминесценции микроскопа (модель – Olympus CX 41) при облучении длиной волны =460 нм и запирающем  красном светофильтре (Рис.4)

Рис.1 Схема генно-инженерной конструкции Lp7N

Сайты клонирования BamHI – NotI

Размер вставки 697 b.p.

Общий размер конструкции LP7N 6125 b.р.

                                                  1       2        3        4

рис.2 Фотографии гель-электрофореза конструкции

1- маркер   1kb DNA Ladder

2- рестрикция  LP7N  по сайтам  BgLII – NotI (размер вставки 1614 п.н., размер вектора 4511 п.н.)

3-  рестрикция  LP7N по сайтам  BamHI-NotI (размер вставки  747п.н., размер вектора 5378 п.н.)

4 - рестрикция  LP7N по сайтам NdeI-XhoI  (размер вставки 1198п.н., размер вектора 4927п.н.)

             а                    б                   в              г

Рис.3 Блот-Гибридизация по Саузерну 

А- Плазмида pDsRed Exspress  ( 4,7 b.p.)

Б- Конструкция  LP7N (6125 b.р.)

В- Вектор pcDNA 3.1.+ (5428 b.p.) (минус контроль)

Г- маркер   1kb DNA Ladder

                                                                      А

                                                                    Б

рис. 4 Флуоресценция культуры клеток, трансформированных конструкцией, содержащей ФБ  pDsRed Exspress под CMV- промотором при T=37 С0 в стволовые клетки коры мозга человека

А – флуоресценция , один день культивации

Б  -  флуоресценция после четырех дней культивации

1.2.Использование  гена зеленого флуоресцентного белка  (pEGFP) в качестве маркера

Аналогично     для  исследования       возможности использования флуоресцентных белков в качестве маркера и  дальнейшего  исследования в стволовых клетках человека была получена генно-инженерная конструкция на основании вектора pcDNA 3.1.+, несущая ген  pEGFP под цитомегаловирусным промотором человека (CMV)(Рис.5)

                    Для получения этой конструкции, из плазмиды pEGFP -N1 был вырезан фрагмент  BamНI-Not I, содержащий ген pEGFP , и встроен в сайты  BamНI-Not I вектора pcDNA 3.1.+.

                    Наличие вставки в этой конструкциии было проверено с помощью рестрикции по сайтам клонирования и электрофореза в агарозном геле (рис.6) Так же  контроль наличия вставки был осуществлен методом блот-гибридизации по Саузерну. Для этого равное количество ДНК (10 мкг), характеризующая наличия встаки (конструкции), чистую плазмиду pEGFP  и плазмиду вектора pcDNA 3.1.+, которую использовали в качестве отрицательного контроля, обрабатывали рестриктазой HindIII.Эта рестриктаза рестрицирует геномную ДНК. Далее рестрицированную ДНК разделяли электрофорезом в 0.8 % агарозном геле с последующей блот- гибридизацией с зондом, полученным на основе кДНК гена pEGFP с использованием среднестатистических (случайных) праймеров. Для  блот-гибридизации было 4 дорожки:  на первую была нанесена линеинезованая плазмида pEGFP  по сайту HindIII, на вторую был нанесен минус-контроль плазмида pcDNA 3.1.+, резанная по сайту рестрикции HindIII, а далее две пробы полученной конструкции также подвергнутые рестрикции по HindIII (2дорожки) (рис.7) В эксперименте не было обнаружено гибридизации в минус контроле рестрикционной  плазмиды  pcDNA 3.1.+, а такжебыло наличие гибридизации на дорожках с конструкцией  LP21N и чистой плазмиды pEGFP.