Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

                    Полученной плазмидой были трансформированны бактериальные клетки штамма XL 1-Blue для нароста. После выделения и очистки эта конструкция были введены в культуру клеток мозга плода человека  методом электропорации. Клетки инкубировались в течение 2-х дней на селективной среде (с неомицином) до появления отдельных колоний. Клеточную культуру рассматривали в свете люминесценции микроскопа (модель – Olympus CX 41) при облучении длиной волны =460 нм и запирающем  сине-зеленом светофильтре (рис.8)

                      Рис.5. Схема генно-инженерной конструкции Lp21N

Сайты клонирования BamHI – NotI

Размер вставки 741 b.p.

Общий размер конструкции 6169 b.p.

Рис.6 Фотографии гель-электрофореза конструкций

А- рестрикция по сайтам  BgLII – NotI

       1- маркер   1kb DNA Ladder

       2- рестрикция  LP21N (размер вставки 1658 п.н., размер вектора 4511 п.н.)

Б- рестрикция по сайтам  BamHI-NotI

        1- маркер  1kb DNA Ladder

         2- рестрикция  LP21N (размер вставки 891 п.н., размер вектора 5278 п.н.)

В- рестрикция по сайтам NdeI-XhoI

          1- маркер  1kb DNA Ladder

          2- рестрикция  LP21N (размер вставки 1242 п.н., размер вектора 4927п.н.)

           а           б            в            г

Рис.7 Блот-Гибридизация по Саузерну 

А - Плазмида  pEGFP -N ( 4,7 b.p.)

Б- Вектор pcDNA 3.1.+ (5428 b.p.) (минус контроль)

В- Конструкция  LP21N (6169 b.р.) (1вариант)

Г-  Конструкция  LP21N (6169 b.р.) (2вариант)

Д- маркер   1kb DNA Ladder

Рис. 8 Флуоресценция культуры клеток, трансформированных конструкцией, содержащей ФБ pEGFP под CMV- промотором при T=37 С0 в стволовые клетки коры мозга человека

                      Обсуждение результатов

Данное исследование является фрагментом большой работы, проводимой в нашей лаборатории по изучению возможностей использования эмбриональных и стромальных стволовых нейральных клеток млекопитающих для трансплантации  в различных областях клеточной терапии, в частности, для лечения нейродегенеративных заболеваний.

В лаборатории «Нейрогенетики и генетики развития» Института биологии гена РАН создается принципиально новая схема регуляции трансгена. Разрабатывается вопрос  возможности использования промотора белка теплового шока (HSP70) дрозофилы в стволовых клетках млекопитающих, т.к. это один из самых активных промоторов и температура его включения выше 27 градусов. Такая система очень удобна для использования в клеточной терапии, т.к. температура тела млекопитающих и человека является автоматическим стимулятором промотора белка теплового шока дрозофилы. Также в данной лаборатории изучается вопрос воздействия нейротрофических факторов и исследуется попытка удаления глиального рубца при трансплантации в мозг млекопитающих.

                    Поскольку эмбриональные нервные клетки  мутанта дрозофилы Delta, содержащие нейротрофический фактор млекопитающих препятствуют образованию глиального рубца,  способствовуют выживанию, росту и дифференцировке человеческих нейронов, актуальную задачу представляет получение генно-инженерных конструкций  для анализа возможностей экспрессии человеческого трансгена под heat-шоковым промотором дрозофилы  и использование элементов генома дрозофилы при трансплантациях эмбриональных стволовых клеток млекопитающих.

                    Первоначальным этапом в  работе  по исследованию генома дрозофилы и возможности его работы в клетках млекопитающих было получение генно-инженерных конструкции для введения гена флуоресцентного белка GFP  и DsRedExspress (в качестве маркера) на основе вектора pcDNA3.1+ под цитомегаловирусным промотором (CMV) млекопитающих (LPN, LPN). Новаторство  полученных конструкций проявляется в использовании флуоресцентных белков в качестве маркера при трансплантации  в мозг млекопитающих (рис.5,8), возможности изучения развития стволовых клеток при трансплантации, а также  для изучения их связи с клетками хозяина. На основании данных конструкций возможно создание генно-инженерных конструкций, когда под одним промотором находится ген флуоресцентного белка и ген нейротрофического фактора. 

На этом этапе  необходимо было проверить:

1.      Будут ли данные белки экспрессироваться в эмбриональных стволовых клетках.

2.      На сколько токсичны данные белки для используемых нами стволовых клеток, и какое время жизни этих белков в клетках.

3.      Возможно ли использовать данную систему стволовых клеток, меченных флуоресцентными белками для трансплантации.

Использование флуоресцентных белков как маркеров для различных видов культур клеток, в том числе и для стволовых культур.

Для этого была сделана конструкция с RedExspress и  GFP генами  под  CMV промотором, с последующим введением их  в культуру эмбриональных стволовых клеток. Наблюдалось интенсивное свечение (Рис 3,8).

                                         Выводы

                    В результате практической деятельности в лаборатории «Нейрогенетики и генетики развития» Института биологии гена РАН  были получены результаты на основании которых можно сделать выводы:

1.            Была получена генно-инженерная конструкция LP21N, включающая маркерный ген красного  флуоресцентного белка  Red Exspress под контролем   цитомегаловирусного промотора (CMV). Показано, что данная система работает в клетках млекопитающих.

2.            Была получена генно-инженерная конструкция LP7N, включающая маркерный ген зеленого  флуоресцентного белка  GFP под контролем   цитомегаловирусного промотора (CMV). Показано, что данная система работает в клетках млекопитающих.

3.            Данные конструкции были инъецированы в культуру клеток мозга плода человека. В результате наблюдалось свечение нейральных клеток мозга, обусловленное наличием флуоресцентных белков.

4.            После введения конструкций наблюдалась нормальное развитие культуры и деление клеток, что говорит о том, что культура может существовать, имея синтетический белок  Red Exspress и GFP.

5.            Было установлено, что красный флуоресцентный белок (Red Exspress) теряется в культуре через несколько поколений, тогда как белок GFP не терялся  в течение всего эксперимента.

Список сокращений

СК- стволовые клетки

РСК- региональные стволовые клетки

МСК- мезенхимные стволовые клетки

ЭСК-эмбриональные стволовые клетки

ССК- стволовые клетки крови

GFAP- кислый глиальный фибриллярный белок

GDNF- человеческий глия-производный нейротрофический фактор

GFP- зеленый флуоресцентный белок

DsRed- красный флуоресцентный белок

BFP - синий  флуоресцентный белок

CFP- циановый флуоресцентный белок

YFP- желтый флуоресцентный белок

CMV- цитомегаловирусный промотор человека

LP21N- конструкция содержащая ген красного флуоресцентного белка

LP7N- конструкция содержащая ген зеленого флуоресцентного белка

Список    литературы

1.            Александрова М.А., Павлова Г.В., Ревищин А.В., Башкиров В.Н., Модестова Е.А., Евгеньев М.Б., Сабурина И.Н., Мерцалов И.Б., Венгрова С.П., Корочкин Л.И.  Эффект чужеродного гена GDNF на развитие гомо- и ксенотрансплантатов в мозгу крысы. Генетика. 2000. Т. 36. N 11.  C. 1553- 1560.

2.            Викторов И.В.  Стволовые  клетки мозга  млекопитающих:  биология  стволовых клеток   in  vitro  и  in   vivo.  Изв. АН, сер. Биол. 2001. N 6. С. 645-655.

3.            Генная терапия - медицина будущего / Редактор-составитель А.В. Зеленин. М.: ВИНИТИ РАН-ППФНТП "Геном человека", 2000.

4.            Корочкин Л.И.   Генетика.   2000. Т. 36.  N 11.   1438-1442.

5.            Корочкин Л.И. Cтволовые  клетки. Онтогенез. - 2003. - Т.34.- N 3 - С. 164-166.

6.            Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития. М. ; Наука, 2002. 263

7.            Корочкин Л.И.  Изв. АН. Сер. Биол.  2001.  N 6.  С.  666-671.

8.            Мусина Р.А., Егоров Е.Е. Стволовые клетки: свойства и перспективы использования в медицине, Молекулярная биология(2004),Т.38,№4,с. 563-577

9.            Лосева Е.В.  Нейротрансплантация  фетальных тканей   и  компенсаторно-восстановительные  процессы  в  центральной  нервной  системе  реципиентов. Успехи Физиол. Наук. 2001. Т. 12. N 1.  С. 19-37.

10.       Репин B.C.. Ржанинова А.А.. Шаменков Д.А. Эмб­риональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. М.: РеМетекс, 2002. 160 с.

11.       М. Сингер, П. Берг, Гены и геномы, том 1, 1998.

12.       Сухих Г.Т., Малайцев В.В. Нейральная  стволовая  клетка:  биология и перспективы  нейротрансплантации. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед.  2001. Т.131.N 2. С. 244-255.

13.       Awad H.A., Butler D.L., Harris M.T., Ibrahim R.E., Wu Y., Young R.G., 2000.

14.       Agrawal S., Kandimalla E.R. Antisence therapeutics: is it as simple as complemenatary base recognition // Molecular Medicine Today. 2000. V. 6. P. 72-81.

15.       McAnaney T.B., Park E.S., Hanson G.T., Remington S.J., and Boxer S.G. (2002) Green fluorescent protein variants as Ratiometric Dual Emission pH Sensors. 2 Excited-State Dynamics. Biochemistry,  15489-15494.

16.       Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. (1999) Circular permutation and receptor insettion within green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  11241-11246.

17.       Ballas C.B., Zielske S.P., Gerson S.L. 2002. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: implica­tions for greater use. /. Cell Biochem. 38, 20-28.

18.       Branchini B.R., Lusins J.oO., and Zimmer M. (1997) A molecular mechanics and database analysis of the structural preorganization and activation of the chromophore-containing hexapeptie fragment in green fluorescent protein. J. Biomol. Struct. Dyn., 441-448.

19.       Brazelton T.R., Rossi P.M., Keshet G.I., Blau H.M. 2000. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science. 290, 1775-1779.

20.       Bjornson C.R., Rietze R.L., Reynolds B.A., Magli M.C., Vescovi A.L. 1999. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science. 283, 534-537.

21.       Bokman S.H., and Ward W.W. (1981) Renaturation of Aequorea green fluorescent protein. Biochem.Biophys. Res. Commun.,  1372-1380.

22.       Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (2002) A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  7877-7882.

23.       Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science,  802-805.

24.       Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M., Prockop D.J. 2000. Rapid expansion of recycling stem cells in cul­tures of plastic-adherent cells from human bone mar­row. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 3213-3218.

25.       Clarke D., Frisen J. 2001. Differentiation potential of adult stem cells.         Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 575-580.

26.       Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsein R.Y. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci., 20, 448-455.

27.       Culver K.W. Gene Therapy. A Handbook for Physicians. 2nd Edition NY: Mary Ann Liebert Inc. Publishers, 1996.

28.       Dai, Y., M. Roman, R. K. Naviaux, and I. M. Verma. 1992. Gene therapy    via primary myoblasts: long-term expression of factor IX protein following transplantation in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895.

29.       Davenport D. nicol J.A.C. (1955) Luminescence in hydromedusae Proc. R. Soc London, Ser. B.,  399-411.

30.       Davidson E.. RastJ.. Oliveri A. et al. A genomic regula­tory network fope development// Science. 2001. V. 295. № 8. P. 1669-1679.

31.       Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M, Yang M.M., and Youvan D.C. (1995) Red-shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescein Protein, BioTechnology, 151-154.

32.       Elsliger M.A., Wachter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry, 5296-5301.

33.       Fradkov A.F., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Bulina M.E., Yanushevich Y.G., Martynov V.I., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. (2002) Far-red fluorescent tag for protein labeling. Biochem. J.,  17-21.

34.       Friedenstein A., Owen  M. Stromal  stem  cells:  marrow  derived  osteogenic  progenitors. CIBA Found.  Symp. V.136, P. 42-60.

35.       Fu YG, Qu YJ, Wu KC, Zhai HH, Liu ZG, Fan DM. Apoptosis-inducing effect of recombinant Caspase-3 expressed by constructed eukaryotic vector on gastric cancer cell line SGC7901. World J Gastroenterol. 2003 Sep; 9 (9).1935-9.

36.                    Ianus A., Holz G.G., Theise N.D., Hussain M.A. 2003. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion. /. Clin. Invest. 111, 843-850.

37.       Ishikawa F., Drake C.J., Yang S., Fleming P., Mi-namiguchi H., Visconti R.P., Crosby C.V., Ar-graves W.S., Harada M., Key L.L.Jr., Livingston A.G., Wingard J.R., Ogawa M. 2003. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice. Ann. NY Acad. Sci. 996, 174-185.