Антоцианы

Исходные растворы, содержащие антоциан, готовились различными приемами: экстрагированием сырья 96%-ным этиловым спиртом (1:1); экстрагированием листьев водой, содержащей серную кислоту, - уд. вес 1,84 (20:70:1) — с последующей осторожной нейтрализацией кислого раствора гашеной известью до получения жидкости фиолетового цвета: разложением свинцового лака антоциана разбавленной серной кислотой с последующей нейтрализацией избытка кислоты известью или водным раствором аммиака. Индикаторная бумага готовилась погружением фильтровальной бумаги в растворы антоциана с последующим ее высушиванием при 25-30°.

В зависимости от способа приготовления раствора антоциана из 1кг красной капусты получают от 1,5 до 7,5м2 индикаторной бумаги сиреневого цвета, которая в сильно кислой среде (рН 2-3)  изменяет окраску на красную, а в щелочной среде (рН 8) – на зеленую.

Возможность использования данного индикатора определяется его доступностью, простотой и дешевизной изготовления и удовлетворительным действием в качестве реагента в простейших аналитических определениях.

Антоцианы применяются также как простые и надежные гистологические красители. П.Ф. Степанов [27] предложил для окрашивания гистологических срезов применять экстракт из ягод голубики. И.Б. Леонов, Н.Н. Кузнецов, В.А, Думбрава и др. нашли эффективный способ получения жидкого гистологического красителя из отходов винограда (авторское свидетельство СССР 137521, 25.04.61).

1.4. Устойчивость антоциановых красящих веществ

Гораздо большее значение, чем непосредственное применение антоцианов, имеют сведения об изменениях антоцианов при технологических процессах переработки плодов и овощей, о их влиянии на коррозию металлической тары и формирование окраски законсервированного пищевого продукта.

Режим нагревания, кислотность среды, световые воздействия, окисление, ферментативные процессы, характер компонентов пищевого продукта и присутствие солей различных металлов – все это оказывает исключительно сильное воздействие на антоцианы и отражается на качестве плодоовощных консервов, джемов, варенья, фруктовых соков и морсов, виноградных вин, плодово-ягодных настоек и других окрашенных антоцианами пищевых продуктов [28-34].

Кроме возможного ухудшения цвета пищевого продукта и накопления солей тяжелых металлов, происходит уменьшение витаминной активности антоцианов, которые, подобно флавонам, обладают полезным для человека биологическим действием.

Приведенные ниже результаты исследований антоцианов представляют несомненный интерес для технологов ряда производств пищевой промышленности, так как не только знакомят с изменениями антоцианов, происходящими при переработке плодов, ягод и овощей, но и предусматривают практические меры по устранению нежелательных изменений в составе пищевого продукта и сохранению его высокого качества.

При производстве виноградных вин в ряде стран разработаны специальные методы ферментативного удаления избытка антоцианов. Однако если этим и достигается улучшение внешнего вида вин, то, насколько сохраняется при этом витамин Р, остается неизвестным. Не имеется исследований и по применению новых приемов осветления сильноокрашенных соков и виноградных вин с одновременным получением продуктов осаждения антоцианов, которые могли бы служить концентратами витамина Р и использоваться в качестве пищевых красителей [27].

1.4.1. Условия  разрушения антоцианов

Вообще исследования антоцианов, содержащихся в различных растениях и пищевых продуктах, проводятся еще в далеко не достаточном объеме, если учитывать запросы различных про­изводств пищевой и особенно фармацевтической промышленности, которая совершенно не выпускает лечебных препаратов, содержащих антоциановые красящие вещества.

Ламором [35] выделены и изучены красящие вещества ягод черной смородины, малины, вишни, садовой земляники и определена скорость разрушения антоцианидинов при нагревании. Наиболее стойким является пеларгонин – красное красящее вещество земляники. Стойкость других пигментов постепенно уменьшается в зависимости от их цвета - от оранжевого оттенка к фиолетовому.

Марканис, Ливингстон, Феллерс [36] провели количественное изучение процесса разложения под влиянием различных факторов  чистых растворов пелартонидин-3-моноглюкозида.

В присутствии кислорода и аскорбиновой кислоты при рН 2,0 – 3,4 и температуре 45-110° разложение пигмента ускоряется. Обработка земляничного сока ферментами, вызывающими окисление аскорбиновой кислоты, удаление кислорода и хранение сока в атмосфере азота увеличивает стойкость окраски земляничного сока. Кратковременное нагревание сока при высокой температуре разрушает пигмент в меньшей степени, чем обычный режим пастеризации в условиях более низкой температуры. Добавление кверцетина к растворам красящего вещества повышает его стойкость.

Ламором [37] описана методика исследования по разрушению антоцианидинов плодов в присутствии воздуха.

Антоцианы плодов экстрагировали бутанолом и разделяли методом хроматографии на колонке из порошкообразной целлюлозы, используя смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:2,5) в качестве растворителя. Для гидролиза антоцианов к 1мл элюата прибавляли 1мл концентрированной соляной кислоты и нагревали до кипения в течение 3мин. Раствор агликонов (рН 1) выдерживали при комнатной температуре в течение 16час. в присутствии воздуха или в атмосфере азота в пробирках Тунберга и определяли скорость разрушения агликонов путем измерения оптической плотности раствора при 250нм. В присутствии азота агликоны разрушались медленнее. Указан период полураспада агликонов в присутствии воздуха: в плодах Vaccinium тасrоеаrроп (пеонидин) - 5час,36мин., Ribes nigrum – 2час, 20мин. (дельфинидин) и 1час,24мин. (цианидин). Fragraria virginiana (пеларгонидин) - 11час,12мин.

А.А. Колесник, Н.А. Базанов [30] провели исследование 5 сортов свежих и переработанных ягод черной смородины и установили, что дубильные вещества представляют собой катехины. Из флавонов имеется кверцитрин, а антоцианы состоят из дельфинидина, цианина и их производных. Содержание дубильных и красящих веществ, составляющее в свежих ягодах 0,39-0,43% на сырой вес, снижается в результате тепловой обработки ягод до 0,10-0,23%; при замораживании свежих ягод с сахаром содержание указанных веществ не изменяется.

Е.Г. Кротов, А.Г. Тертилова [28] установили, что потеря розового цвета вареньем из розы при хранении связана с разрушением антоцианов, а потемнение происходит в результате образования меланоидинов. Эти процессы более интенсивны в присутствии кислорода и при повышенной температуре хранения. Увеличение кислотности добавлением лимонной кислоты в начале варки варенья способствует лучшему сохранению антоцианов.

Разрушение антоцианов происходит гораздо быстрее в атмосфере воздуха, чем в вакууме. Сильно разрушаются антоцианы под влиянием света даже в отсутствие кислорода воздуха. Повышение концентрации аскорбиновой кислоты в соках оказывает отрицательное действие на антоцианы, в то же время для аскорбиновой кислоты они являются защитным агентом [29].

Антоцианы менее устойчивы, если плодовые соки хранят в таре из полиэтилена и полипропилена, а не в стеклянной таре, что связывают с проницаемостью полимерных материалов для кислорода воздуха. Различия в изменении цвета плодовых соков зависят от содержания антоцианов, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ и т.д. Предполагают, что разложение антоцианов происходит главным образом путем самоокисления.

М.Л. Фрумкин, Л.П. Ковальская, Е.В, Дорофеева [29] показали, что характер изменений и превращений антоцианов земляники, малины, черной смородины, вишни и сливы при стерилизации теплом и ионизирующими излучениями качественно одинаков, но содержание оставшихся антоцианов всегда выше при стерилизации теплом.

В. И. Рогачев и др. [33] установили, что красящие вещества свеклы с максимумом поглощения при 470-480нм полностью исчезают при тепловой обработке и в значительной мере сохраняются при облучении.

1.4.2. Влияние антоцианов на внешний вид продуктов и коррозию

Харпер [34] провел обзор работ, посвященных влиянию солей металлов, ферментов, танинов, пектиновых веществ, нагревания, света и других факторов и процессов на устойчивость антоцианов в пищевых продуктах. Указана роль антоцианов в процессе коррозии консервных банок из белой жести. Отмечается недостаточная изученность химии антоцианов и их поведения при консервировании пищевых продуктов. Во избежание нежелательных изменений внешнего вида пищевых продуктов, содержащих антоцианы, рекомендуется: не допускать соприкосновения продукта с металлами (исключая нержавеющую сталь) в процессе производства; максимально сокращать продолжительность тепловой обработки продукта, предпочитая обработку при более высокой температуре в течение короткого времени с последующим быстрым охлаждением; удалять кислород из продукта и верхнего незаполненного про­странства тары.

А.Р. Ветчинкин [38] занимался изучением вопроса влияния антоцианов и дубильных веществ на коррозию металлов в различных условиях. Установлено, что в слабокислой среде антоцианы вступают в соединение с солями тяжелых металлов и дают нерастворимые цветные осадки. Коррозия металлов от действия антоцианов и дубильных веществ должна учитываться и устраняться на предприятиях пищевой промышленности, связанных с переработкой плодов и овощей, так как она влияет на накопление солей тяжелых металлов и изменение окраски антоцианов, вызывая ухудшение качества и даже порчу пищевых продуктов.

Ян, Стил [39] отмечают, что избыточное содержание антоцианов в черной смородине ухудшает внешний вид изготовленных из нее джемов, желе, а также вин вследствие образования налета на стенках бутылок. Частичное удаление пигмента достигается введением в сок ягод фермента антоцианазы в количестве 0,1% что улучшает внешний вид продуктов переработки.

Риберо-Ганон [40] показал, что антоцианы вина в связи с изменением окислительно-восстановительного потенциала играют важную роль в процессе его старения. При старении вин, возможно, происходит деметоксилация энина и энидина.

Бергом [41] исследовано поведение антоцианов при брожении и хранении красных вин измерением оптической плотности при 425 и 525нм. Красящие вещества адсорбировали из вина порошком нейлона, вымывали раствором вода – метанол – уксусная кислота (25:75:5 по объему). В ходе брожения окрашенного сусла происходит снижение содержания антоцианов на 40%. Содержание лейкоантоцианов уменьшается в течение 9 месяцев, затем повышается. В вине при старении происходит процесс полимеризации антоцианов.

Либерлян-Гайон Паскаль [42] установил, что при старении красных вин происходит гидролиз антоцианов, их конденсация с последующим осаждением, деметоксилирование. Образующиеся при гидролизе антоцианов агликоны нестабильны и не поддаются идентификации. В молодом вине при хроматографировании образуются четкие пятна антоцианов, которые можно идентифицировать, а в старом вине на хроматограммах, вместо четких пятен, получаются коричневые полосы продуктов конденсации антоцианов, которые трудно идентифицировать.

Синглетон, Берг, Гуймон [43] установили, что вина типа портвейна с повышенной интенсивностью окраски, вызванной добавлением спирта, обогащенного альдегидами, характеризовались более высоким содержанием антоцианов, устойчивостью окраски к изменению рН и пониженной концентрацией полифенолов. При длительном хранении разница между опытными и контрольными образцами уменьшалась, но полностью не исче­зала. Предполагают, что антоцианы образуют с альдегидами окрашенные вещества с низкой реакционной способностью. Они легко адсорбируются полиамидным порошком и склонны к полимеризации.

1.5. Аналитические методы получения, идентификации и  количественного определения антоцианов

Приемы выделения антоцианов в виде хлоридов, обладающих свойством растворяться в метиловом спирте и осаждаться избытком эфира, рекомендованы Вильштеттером, Мигом, Больтеном, Видмером, Каррером и другими исследователями [14]. Эти методы хотя и позволяют получить достаточные количества красящих веществ, необходимые для химического анализа, но отличаются длительностью, осложнены многочисленностью операций по перекристаллизации красящих веществ и не всегда обеспечивают достаточное разделение смеси близких друг к другу по свойствам красящих веществ.

Эти недостатки были устранены введением в практику исследований природных красящих веществ хроматографического метода М.С. Цвета и метода электрофореза на бумаге.

В многочисленных работах по выделению, разделению, идентификации и количественному определению антоцианов, содержащихся в различных объектах, в настоящее время использованы приемы хроматографии на бумаге и на колонках из разных адсорбентов [41-45].

Для разделения антоцианов, лейкоантоцианов и антоцианидинов методом хроматографии на бумаге предложены следующие смеси; уксусная кислота - соляная кислота - вода (3:1:8 и 30:3:10); н-бутанол - уксусная кислота - вода (6:1:2 и 10:1:3); м-крезол - уксусная кислота - вода (50:2:48); 90%-ная муравьиная кислота - 3н соляная кислота (1:1) [44].

При колонковой хроматографии антоцианов в качестве адсорбентов используются гипс, углекислый кальций, окись алюминия, силикагель, целлюлозный порошок, смесь порошкообразного найлона и целита, а в качестве растворителей и элюентов - теплый водный раствор соляной кислоты, изопропиловый спирт, метанол, метанол - 1%-ная соляная кислота, органическая фаза смеси бутанол - 2н. соляная кислота, 25%-ная уксусная кислота и др.

При этом предпочтение в ряде случаев отдается целлюлозе, из которой адсорбированные красящие вещества извлекаются подкисленным соляной кислотой метанолом, этанолом или бутанолом.

В отдельных методах выделения антоцианов применяют сочетание приемов осаждения антоцианов солями свинца и олова или пикриновой кислотой с приемами хроматографического анализа.

Для идентификации антоцианов широко используют цветные реакции значения Rf и данные видимой и ультрафиолетовой областей спектров в сравнении с синтетическими стандартами и чистыми препаратами естественных красящих веществ.

Методы количественного анализа антоцианов разработаны в меньшей степени, чем для флавонов. Исключение составляют лишь методы, разработанные применительно к определению антоцианов в красных виноградных винах.