Антоцианы

Если ЛК50 за 72 ч К2Сr2О7 не находится в указанном диапазоне реагирования, проверяют науплиусов артемий из новой порции яиц той же партии, или заменяют партию яиц.

При биотестировании выполняют следующие операции.

              1. В чашки Петри наливают по 40 см3 различных концентраций растворов веществ (смеси веществ) и контрольную воду.

              2. В каждый из контрольных и опытных сосудов пастеровской пипеткой помещают по 20 науплиусов в возрасте до 1 сут. Повторность в контроле и опыте трехкратная. Контролем служит искусственная морская вода необходимой солености.

              3. Продолжительность биотестирования составляет 72 ч. На протяжении этого времени науплиусов не кормят.

              4. Подсчет науплиусов, которые выжили в контроле и опыте, проводят визуально на лабораторном столе под бинокуляром МБС.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Природные антоцианидиновые пигменты относятся к широко распространенной в высших растениях группе флавоноидов. Им присущи все известные для полиоксифенолов свойства, но благодаря наличию оксониевого фрагмента антоцианы относятся к весьма лабильным соединениям, окраска которых зависит от кислотности среды и наличия некоторых ионов. Хромофорные свойства обусловили их применение в качестве водорастворимых пищевых красителей с нестабильной окраской. Наличие в гетероциклическом атоме фрагмента положительного заряда обуславливает способность антоцианов присоединять нуклеофильные частицы и заряженные группы биомолекул. Наличие сопряженных гидроксилов позволяет создавать комплексы с металлами переменной валентности, приводящие к изменениям окраски. Химическая структура определила широкий спектр биологического действия, благодаря чему к антоцианам привлечено внимание исследователей.

Одним из условий эффективного применения природных антоцианов в качестве биологически активных компонентов в лечебно-косметических составах является их очистка от сопутствующих экстрактивных веществ. В данной работе были использованы некоторые методы выделения антоцианов из экстрактов.

В качестве сырьевых источников антоцианов были изучены цветки растений медуницы лекарственной Pulmonaria officinalis L., герани луговой Geranium pratense L., герани лесной Geranium sylvaticum L., цикория обыкновенного Cichorium intybus L. Все названные растения имеют значительные сырьевые ресурсы на территории Башкортостана и могут быть отнесены к возобновляемому растительному сырью. В качестве сравнения по составу и свойствам рассматривали традиционное сырье - плоды чёрной смородины Ribes nigrum L., аронии (черноплодной рябины) Aronia melanocarpa Elliot. и красного винограда Vitis vinifera L. var. rubra.

Физико-химические свойства антоциановых агликонов и гликозидов обусловили способ извлечения подкисленным HCl 70 % этанолом, однако для очистки от веществ нефенольной природы требовалось применять дополнительную очистку Одним из способов выделения индивидуальных антоцианов является метод сорбции на тальке. После удаления спирта из полученных экстрактов остаток смешивали с тонкоизмельченным тальком для сорбции целевых продуктов. Получали сорбированный антоциансодержащий концентрат. Трудности представлял подбор соотношения концентрат–сорбент для избежания больших потерь. В ходе экспериментов для каждого вида сырья установлены соответствующие пропорции. Для удаления примесей на фильтре сорбированные образцы многократно промывали охлажденным до 5 0С дистиллятом. В завершении этапа суммарные антоцианы в смеси с другими флавоноидами десорбировали этанолом.

Далее подбирали условия отделения антоцианов от флавонов хроматографическими методами. Были испытаны различные известные из литературы системы, применяемые для флавоноидных смесей. Данные ТСХ показали, что для силикагеля применимы системы этилацетат – уксусная кислота – вода (11:4:4) и хлороформ – этилацетат (4:1). Для талька удовлетворительные результаты показали системы н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5) и изоамиловый спирт – уксусная кислота – вода (2:1:1). После очистки антоцианов от флавоноидов других классов колоночной хроматографией на тальке как наиболее эффективном сорбенте установили, что для всех видов сырья суммарный выход 3-глукозилокси-4’,7-дигидрокси-3’,5’-диметоксифлавилиум хлорида; 3-глюкозилокси-(6-О-(4-гидроксициннамоил)-4’,7-дигидрокси-3’,5’-диметоксифлавилиум хлорида; 3-глюкозилокси-(6-О-(3,4-гидроксициннамоил))- 4’,7-дигидрокси-3’,5’-диметоксифлавилиум хлорида составил до 65 % от исходного количества флавоноидов.

Для экстрактов из плодов аронии и черной смородины, а также цветков герани были изучены методы очистки антоцианов от танинов в двухфазной системе. Применяли систему этилацетат-вода, при этом получали концентраты с более насыщенной окраской (ярко красная в интервале pH 2-4). Для селективной фракционной экстракции агликонов из водных растворов применили двухфазную систему изоамиловый спирт- гексан. Весовой метод показал, что из очищенного суммарного концентрата в зависимости от вида сырья можно выделить до 20% антоцианидинов.

Полученные после элюирования с колонки суммарные антоциановые препараты использовали для изучения физико-химических и биологических свойств. Технический эффект примененной системы методов очистки заключается в том, что он обеспечивает с одной стороны, получение достаточно однородной смеси антоцианов, обладающей высокой эффективностью окрашивания растворов, и с другой стороны он дает возможность наработать фракции антоциановых пигментов, которые можно подвергнуть химической модификации.

Однако все эти процессы являются трудоемкими и занимают большое количество времени, поэтому нами также был изучен синтетический метод получения антоцианов конверсией из других флавоноидов. В качестве исходных веществ были использованы хроматографически чистые кверцетин и рутин после перекристаллизации их соответственно из 96% и 80% этанола. Реакцию восстановления ZnHg проводили до тех пор, пока цвет раствора не изменился из насыщенно жёлтого на ярко-красный. Конверсия прошла за достаточно короткий временной интервал, который составлял от 7 до 9 минут. Контроль осуществлялся в подобранных системах ТСХ. Схема реакции приведена на рис. 1.

Рис.  1. Восстановление рутина с образованием оксониевого фрагмента антоциана

После двукратной перекристаллизации из 96 % этанола определили выход продуктов. Он составляет для веществ, полученных из кверцетина и рутина, 54 и 57% соответственно, что можно считать вполне удовлетворительным результатом ввиду упрощенной и быстрой процедуры химической конверсии.

После выделения и очистки суммарных антоциановых концентратов провели количественное определение по выходу и в пересчете на полученный конверсией флавонола стандарт – цианидин-глюкорамнозид.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цианидин-глюкоманнозид абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

где Dst - Dх – оптическая плотность испытуемого раствора; Vx – объем раствора А, мл; Vst – объем раствора стандарта, соответствующий Dst; R – разведение исходного раствора; a – навеска образца, мг.

Результаты статистической обработки полученных данных показали, что ошибка единичного определения при доверительной вероятности 95% находится в пределах 3,5 %.

Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительные данные по содержанию суммарных антоцианов в различном сырье

Нами был применён фотометрический метод определения антиоксидантной активности и было произведено сравнение их свойств с другими антиоксидантами. В системе Fe(III)/Fe(II)–о-фенантролин установлено, что все изученные экстракты проявляли более выраженное антиоксидантное действие (АОД) по отношению к известным веществам – аскорбиновой кислоте и кверцетину и их смесям. Так, суммарный антоциановый комплекс из цветков герани луговой превышал АОД смеси кверцетин + аскорбиновая кислота в 3,2 раза, а тот же комплекс из цветков медуницы лекарственной – в 1,6 раза. Предположительно, полученные растительные экстракты лишь в небольшом количестве содержали комплексы с дубильными веществами и димерные компоненты, обладающие синергетическим эффектом, проявляющимся в антагонизме по отношению к окислителям в водных растворах. Широкое распространение исследуемого сырья, значительное содержание и выявленная физиологическая активность антоцианов цветков и плодов, а также антоцианов наземной части растения позволяет считать данный вид перспективным для комплексного хозяйственного использования.

Однако существующие способы получения антоцианидиновых красителей как из пищевого растительного сырья, так и из коры различных пород древесины позволяют получать красители, не обладающие высокой термо- и светостойкостью, изменяющие свой цвет в водном растворе при рН более 3,5.

Для повышения термо- и светостабильности пищевых антоцианидиновых красителей широко используются химические способы их модификации. Нами были разработаны некоторые способы стабилизации структуры антоциановых красителей и дальнейшее сравнение свойств между модифицированным и только что выделенным красителем.

В нашей работе был изучен метод модификации антоцианового красителя при помощи реакции присоединения кетокарбоновых кислот в растительном сырье. Для реакции была использована α-кетоглутаровая кислота в енольной форме (рис. 2.).

R1 = H, R2 = OH – цианидинхлорид; R1 = OH, R2 = OH – дельфинидинхлорид; R1 = OCH3, R2 = H – пеонидинхлорид.

Рис. 2. Схема модификации антоцианового красителя присоединением кетоглутаровой кислоты.

Изучена свето- и термостабильность модифицированного и обычного красителя, полученного из коры цветков медуницы, герани и цикория. Известно, что антоцианидиновые красители в растворах при рН более 3,5 теряют интенсивность окраски при освещении или при нагревании в течение нескольких минут.

Показано, что модифицированный краситель из цветков медуницы, герани и цикория в несколько раз светостабильнее обычного. Так, оптическая плотность спиртового раствора 1*10-4 моль/л в стеклянной кювете с толщиной слоя в 1 см при обычном освещении в течение 60 минут падает в два раза, а оптическая плотность модифицированного пировиноградной кислотой красителя, определенная в аналогичных условиях, уменьшается на 4-5 %.

Также в ходе работы были получены хлор- и бромангидриды галловой кислоты с выходами 70% и 45% соответственно. Полученным хлорангидридом проводили ацилирование наработанных антоцианов (Рис. 3).

Рис. 3. Схема модификации антоцианов ацилированием галогенангидридом галловой кислоты.

Экстракты природных антоциановых красителей содержат не только пигменты антоцианов, но и сопутствующие природные соединения, например, гидролизуемые дубильные вещества, часть из которых в условиях эксплуатации красителей вступают в многочисленные химические реакции между собой и с молекулами антоцианов, что приводит к изменению свойств красителей и окрашенных ими растворов. Этому способствует ферментация в процессе созревания винных продуктов и осветлении соков.

Высокая степень ацилирования, особенно радикалами кислот, склонными к образованию внутримолекулярных ассоциатов, обычно приводит к большей устойчивости антоцианов. Причем ацилирование флавоноидов ароматическими кислотами значительно повышает стабильность этих соединений. С этой зрения мы и рассматривали галловую кислоту как перспективный реагент с полезными свойствами и возможный стабилизатор структур.

В условиях ацилирования разрушается олигомерный пигмент проантоцианидин, увеличивая содержание красных пигментов, а антоцианы и флавоноиды превращаются в более гидрофобные ацилпроизводные, обладающие меньшей химической реакционной способностью, особенно в реакциях окисления и конденсации. Концентрат водно-этанольного экстракта ацилированного антоцианового красителя представляет собой сиропообразную жидкость интенсивно-красного цвета, со слабым специфическим запахом и обладает красящей способностью в более широком интервале кислотности раствора, при одинаковой концентрации антоцианов интенсивность его окраски при рН=5,0 значительно выше, чем для исходного красителя. Сочетание природных составляющих предполагает получением нетоксичного продукта, который возможно использовать в пищевой промышленности.

В ходе последующей работы была применена реакция антоцианидина с ангидридом янтарной кислоты (Рис. 4).

Рис. 4. Схема модификации антоцианов янтарным ангидридом

Отношение наработанных антоцианов и янтарной кислоты брали 1:1 и 1:3. Реакцию проводили в присутствии каталитических количеств 4-диметиламинопиридина (DMAP) в безводном пиридине при комнатной температуре. Предполагалось в дальнейшем использовать продукт реакции для получения конъюгатов с аминоспиртами, но ввиду технических осложнений этот план не реализовали.