Антоцианы

Затем смешали полученные растворы, выпарили растворитель до сухого состояния.

2.1.4.     Количественное определение фракции антоцианов из разного сырья в пересчете на синтезированный цианидин-глюкоманнозид

Навеску антоциансодержащего препарата растворяют в 30 мл 70%-ного спирта и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Перемешав, доводят объем фильтрата спиртом до метки (раствор А).

2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2%-ного раствора хлорида алюминия в 95%-ном спирте и доводят объем раствора 95%-ным спиртом до метки. Через 20 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95%-ным спиртом до метки.

2.2.           Модификация антоциановых красителей

2.2.1.     Реакция ацилирования β-кетоглутаровой кислотой в растительном сырье

              Поучение β-кетоглутаровой кислоты

В 5-литровую круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, наливают 3кг (1555мл) дымящей серной кислоты с 20% свободного серного ангидрида. Колбу погружают в смесь льда и соли и, когда температура кислоты понизится до -5°С, пускают в ход мешалку и постепенно добавляют 700г (3,64 мол.) измельченной фармакопейной лимонной кислоты. Скорость прибавления регулируют в зависимости от температуры реакционной массы. Температура не должна подниматься выше 0°С, пока не будет добавлена половина всего количества лимонной кислоты. После этого температура может подняться, но не выше 10С° до завершения реакции. При хорошем охлаждении добавление лимонной кислоты ведут в течение 3-4 час. К концу этого времени лимонная кислота обычно нацело переходите раствор. Если в жидкости останутся твердые частицы, то перемешивание продолжают до полного растворения их.

Когда вся кислота растворится, температуру реакционной массы постепенно поднимают до начала обильного выделения газа, после чего немедленно охлаждают колбу ледяной водой. Охлаждение регулируют таким образом, чтобы не было слишком сильного вспенивания, однако не следует охлаждать до полного прекращения выделения газа (примечание 3). Когда сильное вспенивание прекратится, массе дают нагреться до 30С после чего ее поддерживают при этой температуре до полного прекращения выделения газа. Конец выделения газа легко заметить, если остановить мешалку и дать массе отстояться. Приблизительно через 1 минуту коричневая жидкость должна стать прозрачной и выделять только небольшое количество пузырьков. Обычно весь процесс занимает 2-3 часа.

Затем реакционную массу опять охлаждают льдом и солью и, когда температура достигнет 0°С, добавляют небольшими порциями 2400 г хорошо измельченного льда с такой скоростью, чтобы температура поднималась не выше 10°С, пока не будет добавлена 3 всего количества льда. Затем температуре можно дать подняться до 25 - 30°С. Прибавлении льда продолжается около 2 часов, после чего массу опять охлаждают до 0°С; выпавшие кристаллы возможно быстрее отсасывают через воронку с пористой стеклянной пластинкой и тщательно отжимают. Ацетондикарбоновая кислота имеет при этом белую или светло-серую окраску. В результате отсасывания и отжимания серная кислота оказывается практически полностью удаленной; для дальнейшей очистки кристаллы переносят в стакан, размешивают с достаточным количеством уксусноэтилового эфира (200-250мл) до образования густой пасты и вновь отсасывают и отжимают. Если ацетондикарбоновую кислоту желают получить совершенно свободной от серной кислоты, то промывку уксусноэтиловым эфиром повторяют. Выход практически сухой ацетондикарбоновой кислоты колеблется от 450 до 475г (85-90% теоретич.). Кислоту можно непосредственно употребить для получения ее эфира. Сама кислота нестойка и через несколько часов начинает разлагаться.

                            Взаимодействие β-кетоглутаровой кислоты с антоцианидином

Для очищения от смол, 10г измельчённого сырья погрузили в круглодонную колбу на 500мл, залили туда 200мл гексана и нагревали в течение 30мин с обратным холодильником и механической мешалкой. После этого, полученную массу отфильтровали на вакууме и высушили.

Полученное сырьё засыпали в круглодонную колбу на 250мл, залили 150мл EtOH (96%), 6мл HCl(конц.),  0,5г α-кетоглутаровой кислоты и кипятили в течение 4 часов с обратным холодильником и механической мешалкой.

Полученную настойку отфильтровали и сырьё промыли 2 раза 20-25мл горячим этиловым спиртом. От полученного экстракта отогнали растворитель и высушили до сухого состояния.

2.2.2.     Реакция ацилирования хлорангидридом галловой кислоты

Получение галогенангидридов галловой кислоты

В круглодонную колбу емкостью 1л, снабженную обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, механической мешалкой, термометром и капельной воронкой поместили 50г галловой кислоты, 250мл сухого хлороформа и 2мл триэтиламина. Реакционную массу нагревали на водяной бане при температуре 45-50° и из капельной воронки в течении 30 мин. Добавляли 100мл хлористого тианила. После прибавления всего количества хлористого тианила смесь кипятили в течение 6-8 часов при 55-60°, за это время галловая кислота полностью переходила в раствор. Растворитель и не вошедший в реакцию хлористый тианил сначала отгоняли при обычном давлении, а затем 2-3 часа при 20-25мм. На кипящей бане. Остаток в виде вязкой массы янтарного цвета, представляющий собой хлорангидрид галловой кислоты, содержит одну молекулу сернистого ангидрида.

Синтез эфиров антоцианидинов с галогенангидридами галловой кислоты

Смешали 1,83г галловой кислоты с 1,2г. пятихлористого фосфора и перемешивали при комнатной температуре в течении 6 часов в сухом бензоле. После завершения реакции отогнали растворитель.

Хлорангидрид галловой кислоты 1г перемешивали с кверцетином 0,18 г в 5мл пиридина в течение 3 часов. Затем быстро переносили реакционную массу в воду с уксусной кислотой. Выпавший осадок отделяли и промывали.

2.2.3.     Реакция антоцианидина с янтарным ангидридом

К раствору 0,30г (0.9ммоль) навески антоцианов в 10 мл безводного пиридина прибавили при перемешивании 0,31г (3,15ммоль) янтарного ангидрида и 0,03г (0.2ммоль) диметиламинопиридина. После 12ч перемешивания реакционную массу разбавили водой (2мл), продукт реакции экстрагировали EtOAc (3*10 мл), органический слой обработали 10%-ной HCl (3x20 мл), затем водным раствором NaHCO3, водой, сушили MgSO4 и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (9г SiO2, элюент – CHCl3).

2.2.4.     Реакция антоцианидина с малеиновым ангидридом

Навеску антоцианидина (0,5г) и (0,7г) малеинового ангидрида перемешивали в 6мл пиридина в течение 3 часов. После чего быстро переносили реакционную массу в воду, подкисленную уксусной кислотой. Выпавший осадок отфильтровали и несколько раз промыли горячей водой и высушили. Спектральный анализ показал наличие только одного продукта реакции – антоцианидин, ацилированный по всем положениям.

2.2.5.     Реакция антоцианидина с ацетоном

К 10мл водного раствора антоцианов добавили 20мл ацетона. Реакцию проводили в течение 3 суток при температуре 40ºС. Полученный раствор выпарили до сухого состояния. Полученное вещество проверили на спектрах.

2.3.           Анализ физико-химических свойств антоцианов

2.3.1.     Методика определения антиоксидантной активности

В опытную пробирку последовательно вносили 0,2мл образца (объем вносимого образца можно изменять в пределах 0,05-0,5мл в зависимости от содержания антиоксидантов в исследуемой пробе), 0,2мл 25мМ раствора о-фенантролина и по каплям приливают 0,2 мл 12,3мМ раствора FeCl3. Затем объем доводят до 3мл 96%-ным этанолом. После перемешивания пробу выдерживают в темноте 10мин. Реакцию останавливают добавлением 1мл 0,4М раствора HCl. Контролем служит пробирка, в которую добавляют по 0,2 мл 25мМ раствора о-фенантролина, 2,6мл 96%-ного этанола, 0,2мл 12,3мМ раствора FeCl3 и 1мл 0,4М раствора HCl. Если экстракт имеет окраску то, в отдельную пробирку вносят объем образца равный взятому для определения, и затем доводят общий объем пробирки до 4мл 96%-ным этанолом. Поглощение образца снимают против раствора 96%-ного этанола. Определенную величину оптической плотности поглощения образца вычитают из поглощения опытной пробирки.

Измерение оптической плотности проводили на фотометре КФК-3-01 при 505нм.

Представленные результаты определены по трем химическим повторностям как средние значения.

2.3.2.     Тонкослойная хроматография

В качестве хроматографической пластинки брали алюминиевую пластинку, покрытую силикагелем. В точки, отмеченные на линии старта, наносят с помощью капилляра испытуемых растворов. При нанесении пробы не должна быть нарушена целостность слоя сорбента. Помещали пластинку в хроматогрфическую камеру, насыщенную парами подвижной фазы, таким образом, чтобы её нижний конец был погружен в слой подвижной фазы на дне сосуда. Элюируют до тех пор, пока слой подвижной фазы не окажется на предварительно обозначенной высоте, примерно в 20-30мм от края пластинки. Хроматографическую пластинку вынимали и сушили.

В качестве элюента для разделения антоцианов использовали следующие смеси: н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5); изоамиловый спирт – уксусная кислота – вода (2:1:1); этилацетат – уксусная кислота – вода (55:20:20); хлороформ – этилацетат (8:2).

2.3.3.     Изменение окраски в зависимости от рН

Для этого взяли спиртовой раствор антоцианов и постепенно прибавляли КОН (исходный рН = 1) и при этом наблюдали изменение окраски.

При рН = 1 наблюдалась ярко-красная окраска, с дальнейшим прибавлением щёлочи происходило потемнение и при рН = 7 цвет раствора изменился до фиолетового, когда раствор стал щелочным (рН = 8-9), раствор стал синего цвета, дальнейшее прибавление КОН привело к зелёной окраске.

Стандартный переход окраски проявили антоцианы аронии и медуницы. Несколько более яркую цветовую реакцию наблюдали у фракции, выделенной из черной смородины. Антоцианы из цветков герани луговой при рН = 6 проявили светло-коричневую окраску, которая в щелочной среде перешла в зелено-коричневую. Это явление будем изучать подробнее в дальнейших опытах. Предположительно с учетом определения антиоксидантной активности в составе фракции из герани луговой могут присутствовать димерные формы антоцианидинов, которые имеют менее яркую окраску.

2.3.4.     Биотестирование по гибели ракообразных Artemia salina

1. Методика основана на установлении различия между количеством погибших личинок артемий - науплиусов в анализируемой пробе (опыт) и воде, которая не содержит токсических веществ (контроль).

              2. Критерием острой летальной токсичности воды (водной вытяжки), раствора вещества (смеси веществ) является гибель 50% науплиусов и более в опыте по сравнению с контролем за 72 ч биотестирования.

Приготовили раствор. Взяли 3г яиц Artemia salina растворили в 250 мл воды.Оставили на несколько дней до вылупливания артемий. На вылупившихся артемий проводим эксперимент.

Приготовили раствор. Взяли 20 мл и растворили и растворили в 100 мл воды. Смешали растворы, в каждую пробирку поместили живых науплиусов.

Подготовка к выполнению биотестирования

1. В качестве тест-объекта используют односуточных науплиусов ракообразных Artemia salina L.

Чтобы получить исходный материал для биотестирования 0,1 г сухих яиц артемий помещают в химический стакан объемом 250 мл и заливают дехлорированной питьевой водой, которую предварительно отстаивают и аэрируют на протяжении суток. Через 30 мин, не взбалтывая содержимое стакана, сливают слой воды над яйцами, которые осели, удаляя таким образом погибшие яйца и пустые оболочки. Процедуру повторяют не менее трех раз. Затем отмытые яйца заливают морской водой необходимой солености, рН 8,0-8,5, с концентрацией кислорода не менее 7 мг/л и при слабой аэрации выдерживают до выклева. Используют  искусственную морскую воду.

Предварительной адаптации артемий к нужной солености не проводят, так как рачек эвригалинный и может переносить соленость в широком диапазоне.

При аэрации и температуре воды (20 ± 2)°С выклев науплиусов происходит через 48 ч.

Науплиусы артемий в течение 3-4 сут. после выклева из яиц не нуждаются в кормлении в связи с эндогенным питанием. Поэтому в эксперименте их не кормят.

              2. Каждую новую партию яиц проверяют на выклев. Используют яйца при выклеве 60-90%. Для получения синхронизованного материала первых науплиусов тщательно отбирают укороченной пастеровской пипеткой, концентрируя их возле одной из стенок направленным источником света (новорожденные науплиусы имеют положительный фототаксис).

За час в стакане накапливаются новые науплиусы, их также переносят при помощи пипетки в отдельный сосуд с морской водой и используют для биотестирования.

              3. Односуточных науплиев проверяют на пригодность к биотестированию. Для этого устанавливают среднюю летальную концентрацию за 72 ч биотестирования (ЛК50 за 72 ч) эталонного вещества калия двухромовокислого (К2Сr2О7). Готовят исходный раствор К2Сr2О7 с концентрацией 1 г/дм3, используя дистиллированную воду. Далее готовят серию растворов К2Сr2О7 с концентрациями от 4,0 до 10,0 мг/дм3, используя контрольную природную воду. Биотестирование этих растворов проводят продолжительностью 72 ч. На основании полученных результатов рассчитывают ЛК50 за 72 ч для К2Сr2О7. Если найденная ЛК50 за 72 ч находится в диапазоне реагирования тест-объекта, который равен 6,5-8,0 мг/дм3 К2Сr2О7, науплиусы пригодны для биотестирования (существуют разные по чувствительности расы артемий).