Антоцианы

Гангули, Сешадри [45] провели выделение наиболее распро­страненных лейкоантоцианидинов следующим  методом. Растительный материал обрабатывают последовательно петролейным эфиром и ацетоном. Ацетоновый экстракт, содержащий практически всю сумму лейкоантоцианидинов, упаривают в вакууме, остаток растворяют в уксусноэтиловом эфире и лейкоантоцианидины осаждают добавлением петролейного эфира. После перекристаллизации из смеси уксусноэтиловый эфир - петролейный эфир лейкоантоцианидины получают в виде почти бесцветного порошка.

Идентификацию лейкоантоцианидинов проводят либо по стабильным кристаллическим производным (ацетат, метиловый эфир, диацетат метилового эфира), либо по образующимся при кипячении лейкоантоцианидинов со спиртовым раствором соляной кислоты антоцианидинам (применяются качественные реакции, хроматография на бумаге, определяются чувствительность к окислению, поглощение в видимой области и т.п.). На основании изучения ультрафиолетовых спектров лейкоантоцианидинов и инфракрасных спектров их метиловых эфиров делается вывод, что все лейкоантоцианидины по своему химическому строению являются флавандиолами. В природе встречаются различные изомеры лейкоантоцианидинов.

Халеви, Эйсен [44] провели выделение и идентификацию антоцианов, содержащихся в лепестках тюльпанов, сочетанием метода осаждения красящих веществ солями свинца с методом хроматографии на бумаге и колонках из целлюлозы. Высушенные лепестки измельчали и гомогенизировали на холоду с метанолом, содержащим 1% соляной кислоты. Полученный после фильтрования экстракт обрабатывали раствором уксуснокислого свинца, осадок свинцовых солей промывали и сушили при комнатной температуре. Сухой остаток разлагали гомогенизированием в течение 5 мин. с метанолом, содержащим 2% соляной кислоты. Хлористый свинец удаляли фильтрованием, а оставшиеся ионы свинца обрабатывали сероводородом. Фильтрат сгущали в вакууме и антоцианы осаждали добавлением эфира. Антоцианы растворяли в малом количестве 1%-ного метанольного раствора соляной кислоты и после стояния на холоду отделившиеся примеси отбрасывали. Раствор упаривали в вакууме досуха, растворяли в малом объеме 1%-ного водного раствора соляной кислоты и взбалтывали с этилацетатом для удаления флавоновых веществ.

Водный слой использовали для разделения антоцианов при помощи нисходящей хроматографии на бумаге, В отдельных случаях применяли хроматографию на колонках из целлюлозы. Основными растворителями служили н-бутанол - уксусная кислота - вода (6:1:2) и 15%-ная уксусная кислота. Антоцианы элюировали с бумаги 5%-ным метанольным раствором уксусной кислоты. Для идентификации антоцианов использовали также дополнительное хроматографирование в 5 иных растворителях (н-бутанол - 2н. соляная кислота, 1:1; фенол - вода, 73:27 по весу; м-крезол - уксусная кислота - вода, 50:2:48; этилацетат - третичный бутанол - уксусная кислота - вода, 5:4:1:3; и 5%-ная уксусная кислота), УФ-спектрофотометрию и хроматографическос изучение продуктов гидролиза антоцианов (2н. соляная кислота, нагревание 45мин. при100º, для последующего разделения на бумаге антоцианидины из гидролизата извлекали изоамиловым спиртом). В лепестках исследованных сортов тюльпанов найдены хризантемин, антирринин (цианидин-3-рамноглюкозид), каллистефин и пеларгонидин-3-рамноглюкозид, а в отдельном случае, кроме того, дельфинидин-3-рамноглюкозид.

Леле [46] выделен антоциан из произрастающего в Индии растения Raphanus candatus Linn по методу осаждения уксуснокислым свинцом. Высушенные стручки (150г) растения экстрагировали 1%-ным этанольным раствором соляной кислоты, экстракт обрабатывали насыщенным раствором уксуснокислого свинца до появления красной окраски и образовавшийся осадок отбрасывали. К фильтрату добавляли уксуснокислый свинец до полного осаждения антоциана. После стояния в течение 12час. осадок свинцовой соли антоциана отделяли, промывали последовательно водой и этанолом, растворяли в уксусной кислоте и вновь осаждали добавлением эфира. Затем свинцовую соль антоциана разлагали обработкой метанолом (100мл), содержащим концентрированную соляную кислоту (8мл). Хлористый свинец удаляли и антоцианхлорид осаждали, добавляя эфир. Для кристаллизации осадок антоцианхлорида (200мг) растворяли в метаноле (13мл), добавляли концентрированной соляной кислоты (1мл) и образовавшиеся через 24часа кристаллы промывали 12%-ной соляной кислотой. После кислотного гидролиза антоцианхлорида в гидролизате идентифицировали глюкозу и мальвидинхлорид (Rf 0,52 в стандартной бутанольной смеси).

А.Р. Ветчинкин [47] установил, что для выделения антоцианов из растительных вытяжек может быть использована их способность осаждаться при действии кристаллического двуххлористого олова. Устойчивые оловянные комплексные соединения антоцианов, образующиеся при этом, отделяются от раствора и могут в сухом состоянии неограниченное время сохранять красящее вещество в связанном состоянии. Путем разложения их кислотами в водной или спиртовой среде получают красные растворы антоцианов или антоцианидинов, подвергающиеся дальнейшей очистке хроматографическим методом.

Байер [48] провел выделение и выяснил природу голубого пигмента василька, применяя метод осаждения, хроматографии и электрофореза. Установлено, что кислотность цветочного сока, полученного из разных цветков (васильки, розы, фуксии) и содержащего соответствующий пигмент, лежит в интервале рН 3,8-5,8; кислотность в большинстве случаев обусловлена наличием яблочной и лимонной кислот. Голубой пигмент устойчив в интервале рН 3,8-6, что отвергает общепринятое объяснение голубой модификации пигмента существованием его в виде щелочных солей, так как последние неустойчивы в слабокислой среде. Голубой пигмент василька получен отжиманием цветков василька с последующей обработкой полученной голубой жидкости спиртом. Выделившиеся голубые хлопья отделяли, растворяли в воде и снова обрабатывали спиртом. Примеси белков удаляли раствором  сернокислого аммония. При обработке голубого пигмента на катионообменниках исчезает голубая окраска и появляется красная; при электрофорезе пигмент движется к аноду. Найдено, что в голубом пигменте содержится 19,2% цианина, железа и алюминия, по 1 части эквивалента на 1 молекулу цианина и незначительное количество других металлов, что указывает на примерно 20%-ное содержание в голубом пигменте комплексов алюминия и трехвалентного железа; остальные около 80% составляет сахарный остаток. Из спектрофотометрических измерений найдено, что железо и алюминий образуют с цианином и циаидином комплексы с отношением числа молекул антоциана к числу атомов металла 1:1 и 3:1; последнее характерно для голубого пигмента. Комплексы с алюминием и железом устойчивы в пределах кислотности, характерной для голубого пигмента василька, и имеют интенсивную голубую окраску. Делается вывод, что голубая окраска пигментов василька обусловлена существованием комплексов алюминия и железа, что подтверждается сходством спектров поглощения синтетических комплексов и природных препаратов антоцианов.

Каррер и Стронг [49] разделяли антоцианы из водных растворов на колонке окиси алюминия. Разделение цианинхлорида и метилового эфира цианинхлорида - паеонинхлорида проведено следующим образом. Раствор, содержащий 1,5г сырого паеонина в 200мл теплой воды, пропускают через колонку активированной окиси алюминия и колонку промывают водой. В верхней части колонки образуется пурпурное кольцо, ниже - светло-голубое, в фильтрат проходит часть паеонина. Промывание водой продолжается до получения бесцветного фильтрата. Содержимое верхней зоны вымывают теплой водой, подкисленной соляной кислотой, и фильтрат выпаривают в вакууме до объема 20мл. При этом выделяется хлопьевидный осадок красителя, который после промывания водой, ацетоном и эфиром опять растворяют в теплой воде и еще раз хроматографируют. При повторном хроматографировании получается та же картина. Продукт вытеснения верхней зоны снова концентрируют, и выпавший осадок кипятят 5-10 сек. с 20мл 0,5н. соляной кислоты до растворения. Раствор быстро фильтруют и охлаждают; выпавшие при 0° кристаллы содержат еще немного паеонинхлорида. Для окончательного получения чистого цианинхлорида без примесей паеонинхлорида проводят третье хроматографирование и перекристаллизацию из солянокислого раствора.

Паеонихлорид извлекается из фильтратов, порученных при первом и втором хроматографировании, следующим образом. Фильтраты совместно концентрируют в вакууме при: 30° до объема 20мл, выпавший при этом кристаллический осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из 50мл соляной кислоты концентрации 0,5н. при непродолжительном кипячении. Препарат, промытый водой, ацетоном и эфиром и высушенный на воздухе, образует тонкие красные иглы, представляющие собой паеонинхлорид.

Каррер и Вебер [49] при исследовании красящих веществ черной мальвы произвели разделение моногликозидов на колонке из гипса. Водный раствор, содержащий 2г хлорида алтеина (алтеин C22H22O12), пропускали через слой влажного гипса высотой 80см. Часть пигментов при этом задерживалась верхней частью колонки, а остальные при промывании уходили а фильтрат, который затем сильно упаривался в вакууме при 30° (фракция 1). Задержанные колонкой пигменты вымывались разбавленной теплой соляной кислотой и после нейтрализации избытка кислоты и кон­центрирования в вакууме снова хроматографировались на гипсе. После второго хроматографирования уже видно разделение на две различно окрашенные зоны, следующие непосредственно одна за другой (верхняя зона – фракция II, нижняя зона – фракция III). Обе зоны вымывались вышеуказанным способом, и фильтраты так же сильно концентрировались в вакууме при 30°.

Каждую из трех полученных фракций осаждали водным раствором пикриновой кислоты и пикрат многократно перекристаллизовывали из кипящей воды. При растворении пикратов 2%-ным раствором соляной кислоты в метиловом спирте и осаждении эфиром были получены .кристаллические антоцианхлориды. Из фракции I выделен моноглюкозид 3,5-диметилового эфира дельфинидина (сирингидин), оказавшийся идентичным энину – красящему веществу вина. В воде вещество образует красный раствор, цвет которого не меняется от добавления раствора хлор­ного железа. Фракции II и III еще не представляли собой индивидуальных веществ; они содержали моноглюкозид 3-монометилового дельфинидина и в качестве примеси – глюкозид дельфинидина.

Эндо [50] применил следующую колончатую хроматографию антоцианов. Порошок целлюлозы ватман В с 5-кратным количеством воды помещают в стеклянную трубку (35×4см), уплотняют резиновой пробкой, обрабатывают водной фазой (около 500мл) смеси бутанол - 36%-ная соляная кислота - вода (5:1:4); до окончания обработки вводят около 15мл сырого экстракта антоцианов и хроматографируют, употребляя в качестве проявителя органическую фазу указанной смеси. Готовую колонку разрезают и антоцианы элюируют метиловым спиртом. Растворы концентрируют, добавляя 2-кратное количество бензола, и получают водные растворы антоцианов или кристаллы. Затем хроматографирование повторяют, чтобы извлечь чистые антоцианы.

Рейхель, Штро, Рейхвальд [51] провели разделение пигментов ягод черной бузины на колонке из целлюлозы, проявление 0,25%-ной муравьиной кислотой, очистку через свинцовые соли; полученные продукты через пикраты переводились в хлориды. Выделены: хризантемин и вещество, названное самбуцинианином (его пикрат имеет темп. пл. 179°. его хлорид кристаллизуется с 4 молекулами воды, является β-3-цианидинпримверозидом).

Хиллисом [52] изучены антоцианины красных листьев и молодой красной коры эвкалипта. Антоциановые пигменты хроматографировали на колонке из целлюлозы. Подвижной фазой служила смесь этилацетат - уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (18:3:1:4). Антоцианы элюировали смесью метанол— 1%-ная соляная кислота (1:1). Для очистки повторно хроматографировали на маленьких колонках. В коре присутствуют хризантемин и дельфннидин-3-глюкозид, в листьях – дельфинидин и дельфинин (дельфнниднн-3.5-днглюкозид).

Чандлер, Суэйн [53] успешно использовали для разделения антоцианов из экстрактов лепестков Dahlia, Streptocarpus и бобов какао хроматографию на колонках из смеси полиамид (порошкообразный найлон) -целит. Концентрированный раствор пигментов вносили в колонку. Смесь антоцианов и антоцианидинов вымывали, беря в качестве растворителя подкисленный бутанол. Для вымывания флавонов использовали водный или абсолютный метанол, для элюции мономерных лейкоантоцианов применили продолжительное промывание колонки водным бутанолом. Этим способом хорошо отделили антоцианы, а также получили в чистом виде антоцианидины, образующиеся из лейкоантоцианов после кислотной их обработки.

Сондхеймер, Караш [54] установили главные антоциановые пигменты лесной земляники. После выделения антоцианы разделялись на колонке из силикагеля, причем обнаружили пеларгонидин-3-моноглюкозид и цнанидин-3-моноглюкозид в отношении 1:1, кроме того, присутствуют два неидентифицированных антоцианиновых пигмента.

Абэ, Хаяси [55] предложено для разделения антоцианов методом хроматографии на бумаге использовать растворитель уксусная кислота - соляная кислота - вода (3:1:8). Показано, что при действии кислот дигликозиды разлагаются ступенчато с образованием моногликозидов и затем антоцианидинов,

Дейтон [56] следующими приемами хроматографии на бумаге изучал состав антоциановых, флавоновых и аурезидиновых пигментов цветков у 7 видов рода Antirrhinum и у некоторых межвидовых гибридов. Лепестки цветков растирали с этанолом, содержащим 1% соляной кислоты. Экстракт хроматографировали в смесях бутанол - уксусная кислота - вода (6:1:2) и м-крезол - уксусная кислота - вода (50:2:48), для агликонов антоцианов применяли смесь уксусная кислота – вода - соляная кислота (30:10:3). Чтобы получить агликоны, пятна флавоновых и аурезидиновых пигментов элюировали 50-70%-ным спиртом, антоцианы – 1 %-ным водным раствором соляной кислоты. Элюаты гидролизовали нагреванием с равным объемом концентрированной соляной кислоты при 100° в течение 1-5 мин. Найдены: антиррин (цианидингликозид) и пеларгонидингликозид, три гликозида апигенина, гликозид лютеолина и два гликозида аурезидина.

Хаяси, Абэ [57] методом хроматографии на бумаге изучен состав антоцианов в красной осенней листве (от оранжево-красной до фиолетово-красной) 74 видов растении, представляющих 25 семейств. Свежесобранные красные осенние листья экстрагировали подкисленным метанолом и экстракты хроматографировали на бумаге. Антоцианы элюировали метанолом, содержащим 5% уксусной кислоты. Элюат (до и после гидролиза 20%-ной соляной кислотой при 70-90°) вновь хроматографировали. Основным антоцианом в осенней листве оказался хризантемин (цианидинмоногликозид), у отдельных семейств обнаружены также гликозиды дельфинидина и пеонидина; последние, возможно, на­ходятся в листьях в форме лейкоантоцианов, так как появляются на хроматограмме после кислотного гидролиза экстрактов. Ацилированные антоцианы не обнаружены.

Ипрасек, Нетушил, Ившинова [58] предложили для разделения антоцианов в неочищенных метанольных экстрактах растений метод хроматографии на бумаге ватман № 1 длиной около 100см с системой растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (10:1:3) и н-пропанол - 3%-ная соляная кислота (65:35). Время разделения 72-100 час.

Ру [59] для идентификации антоцианидинов, лейкоантоцианов и 2,3-дигидрофлавонолов в тканях растений использована хроматография на бумаге с просмотром хроматограмм на спектрофотометре. Растворителями служили смеси: 90%-ная муравьиная кислота - 3н соляная кислота (1:1) и вода - уксусная кислота – концентрированная соляная кислота (10:30:3). Приводятся значения Rf  в этих растворителях для дельфинидина, цианидина, пеларгонидина и др.

Харборном [60] определены спектры 50 различных антоцианов и антоцианидинов. Для получения пигментов свежий растительный материал настаивали с метанолом и концентрированной соляной кислотой (97:3) при комнатной температуре, экстракт центрифугировали и фильтровали через целиг, упаривали в вакууме до небольшого объема и наносили в виде полосы на бумагу ватман № 3. Бумагу помещали на 24час. в камеру, заливали туда нижний слой смеси н-бутанол - 2н соляная кислота (1:1), после чего хроматографировали с верхним слоем той же смеси. Антоцианы элюировали смесью вода – метанол - уксусная кислота (25:70:5). Антоциан очищали от полифенольных загрязнений хроматографированием на бумаге с растворителем бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) и повторно с растворителем вода - уксусная кислота (85:15). Элюировали с бумаги смесью вода - метанол - уксусная кислота (25:70:5) и выпаривали в вакууме досуха. Чистоту антоцианов проверяли хроматографированием их антоцианидинов. Для спектрофотометрирования чистый антоциан растворяли в метаноле, содержащем 0,01% концентрированной кислоты, и измеряли спектры в видимой части. Чтобы определить спектр антоциана в присутствии хлористого алюминия, к раствору антоцианина прибавляли 3 капли 5%-ного спиртового раствора хлористого алюминия. Для сравнения спектр измеряли в этаноле или воде.