Антоцианы

Как известно, синтез сложных эфиров можно осуществить различными способами. Поскольку антоцианы относятся к соединениям фенольной природы, ввести кислотный остаток прямым действием карбоновой кислоты не удаётся из-за низкой нуклеофильности.

Ацилирование антоцианидина проводили по классической методике действием на него малеинового ангидрида в пиридине. В этих условиях получается продукт ацилирования по положениям 4 и 7 (Рис. 5)..

Рис. 5. Схема модификации антоцианов малеиновым ангидридом

Подтверждением образования ацетата антоцианидина служит уменьшение интесивности в ИК-спектре полосы фенольных гидроксилов в области 3300-3400см-1 и появление интенсивности сигнала сложноэфирной группы при 1712см-1. Выход продукта составил 86%.

Продукт был разработан для дальнейшего получения следующего соединения:

Рис. 6. Получение цинковой соли ацилированного антоциана

Также был использован метод стабилизации антоциановых пигментов при помощи реакции с ацетоном. Реакцию проводили растворив экстракт антоцианов в ацетоне в течении 3 суток при температуре 40ºС (Рис. 7).

Рис. 7. Взаимодействие антоциана с ацетоном

              Предполагаемый механизм реакции по-видимому связан с электронно-донорной енольной формой ацетона в результате присоединения к С4 пирилевой соли с образованием внутримолекулярного геми-ацетатного образования (Рис. 8).

Рис. 8. Предполагаемый механизм реакции антоцианов с ацетоном 

Было установлено, что у полученного продукта светостабильность в значительно выше, чем у нативного красителя.

После проделанных модификаций были изучены свойства природных и модифицированных антоцианов. Наличие большего числа гидроксилов в замещенных антоцианах должно способствовать усилению антиоксидантного действия. Для проверки этого провели изучение АОА полученных модифицированных продуктов.

Введение в окислительно-восстановительную систему Fe(III)/Fe(II) органического лиганда – о-фенантролина увеличивает величину стандартного редокс-потенциала полуреакции [Fe(Phen)3]+3 + ē → [Fe(Phen)3]+2 до E° = 1,10 В, расширяя круг определяемых веществ. Следует также отметить, что способность органического лиганда образовывать с восстановленной формой железа устойчивый в широком диапазоне рН (2 – 9) окрашенный хелат со значительным молярным коэффициентом поглощения (ε = 11100) создает условия для высокочувствительного и селективного определения. Это позволяет использовать систему Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин для определения антиоксидантной способности биологически активных соединений.

Окислительно-восстановительная способность выбранной индикаторной системы и чувствительность определения зависят от количества и соотношения Fe(III) и о-фенантролина, которые целесообразно вводить в реакцию совместно в виде комплексного реагента.

Оптимизацию состава реагента проводили методом многофакторного планирования эксперимента, который позволил выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности. Факторами выступали – концентрация Fe(III), о-фенантролина, источникFe+3 и объем реагента, вводимый в реакцию с восстановителем. В качестве восстановителя выбрана аскорбиновая кислота, ввиду ее высокого окислительно-восстановительного потенциала и возможного присутствия в предполагаемых объектах исследования. Границы варьирования уровней факторов определялись шириной диапазона линейности зависимости аналитического сигнала от концентрации аскорбиновой кислоты (0,05 – 2,0 мкг/см3), с одной стороны, и достаточной чувствительностью и устойчивостью аналитического сигнала во времени, с другой.

Для каждого состава реагента, по уравнениям регрессии, была рассчитана величина аналитического сигнала при концентрации аскорбиновой кислоты 1,2 мкг/см3 и подобран объем, при котором значение аналитического сигнала максимально. Дальнейшие расчеты позволили заключить, что оптимальным является реагент состава: 0,006 М Fe(III) – 0,01 М о-фенантролина, при его объеме, вводимом в реакцию 1,0 см3 на 100 см3 раствора.

Для доказательства суммарного характера определяемой величины АОА рассматривалось влияние восстановителей органической природы и их суммы на индикаторную систему.

Изучено влияние ряда индивидуальных восстановителей на систему Fe(III)–о-фенантролин оптимального состава. Для исследования выбраны широко распространенные в растительном сырье, материалах и используемые в пищевой промышленности антиоксиданты фенольной (кверцетин) и нефенольной (аскорбиновая кислота) природы.

Для стабилизации аналитического сигнала путем вывода из реакции не прореагировавших ионов Fe+3 в реакционную смесь вводили «стоп-реагент», в качестве которого применяли фторид натрия в диапазоне концентраций 0,006 мМ – 0,01 М.

Для изучаемых восстановителей введение в реакцию 0,01 М фторида натрия обеспечивает стабильный во времени аналитический сигнал.

В аналогичных условиях были получены стабильные во времени аналитические сигналы для реальных объектов. Это позволило рекомендовать фторид натрия в качестве «стоп-реагента» при определении антиоксидантной активности растительного сырья.

В результате проделанных измерений можно составить следующую схему (Рис. 9).

По оси абсцисс:

1-кверцетин, 2 - синтетические антоцианы, 3 - природные антоцианы, 4 - модифицированные α-кетоглутаровой кислотой, 5 - модифицированные хлорангидридом галловой кислоты, 6 - модифицированные янтарным ангидридом, 7 - модифицированные малеиновым ангидридом, 8 - модифицированные ацетоном.

Пот оси ординат:

показатели оптической плотности комлексов железо (III)-o-фенантролин

Рис. 9. Сравнительные данные по антиоксидантному действию природных и модифицированных антоцианов

При изучении влияния рН на окраску антоцианов было выяснено, что при рН = 1 для нативных веществ наблюдалась ярко-красная окраска, с дальнейшим прибавлением щёлочи происходило потемнение и при рН = 7 цвет раствора изменился до фиолетового, когда раствор стал щелочным (рН = 8-9), раствор стал синего цвета, дальнейшее прибавление КОН привело к зелёной окраске. Это указывает на возможность применения антоцианов как индикаторов при титровании растворов солей некоторых переходных металлов или других веществ.

В завершении данной работы было изучено влияние природных и полусинтетических антоцианов на острую токсичность окислителя и гербицида в биотестах с солоноводным рачком Artemia salina. Результаты представлены в табл. 2.

Длительность тестов вместе с подготовкой занимает не более 6 суток, метод весьма чувствителен, информативен. Достаточно хорошо заметны различия в результатах испытания близких по строению препаратов, в нашем случае это были антоцианы медуницы и антоцианы, полученные конверсией рутина . Считаем, что метод тестирования на Artemia salina более применим к оценке токсичности новых малоизученных соединений.

Таблица 2.

Результаты тестов на токсичность индивидуальных соединений и бинарных смесей с включением антоцианов

* 2,4-Д – гербицид 2,4–дихлорфеноксиуксусная кислота; **№ 1 полусинтетические антоцианы; ***№ 2 - экстрактивные антоцианы медуницы

Поскольку в современных технологических схемах задействован, как правило, ряд химических соединений, и в результате производственного цикла в качестве отходов образуются смеси веществ, были проведены соответствующие опыты для оценки совместного влияния бинарных компонентов на тест-объекты. Из представленного материала видно, что смеси таких токсикантов, как бихромат калия и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота проявляют ожидаемое взаимоусиливающее действие, которое проявляется уже на первые сутки эксперимента. В то же время, добавление к окислителю бихромату калия как природных антоцианов, так и полученных конверсией рутина полусинтетических продуктов значительно снижает его токсичность. Это можно считать явным потверждением антиоксидантного действия антоцианов in vivo.

Однако проявленный эффект по снижению токсичности гербицида 2,4-Д по отношению к водному организму однозначно объяснить сложно. Возможно, данный тип гербицида также может инициировать протекание каких-либо окислительных или радикальных процессов, которые останавливают антоцианы.

ВЫВОДЫ

1.      Водно-спиртовой экстракцией с последующей очисткой препаративной хроматографией наработаны концентраты антоцианов из части видов растительного сырья. Максимальный выход целевых продуктов установлен в цветках герани  луговой и медуницы лекарственной,  соответственно  4,3 и 5,8 %. 

2.      Реакцией восстановления амальгамой цинка в среде этанола проведена конверсия рутина в цианин-рутинозид с выходом 58 %.

3.      Подбор реагентов для химической стабилизации γ-пиронового фрагмента антоцианов показало, что наиболее эффективной является химическая модификация  структуры  с помощью α-кетоглутаровой кислоты.

4.      Сравнительное изучение антиоксидантной активности природных флавоноидов и синтезированных производных антоцианов в системе Fe(III)-o-фенантролин позволило установить, что наиболее выраженными свойствами обладает продукт, этерифицированный галловой кислотой

5.      В опытах по биотестированию на водных организмах Artemia salina показано, что природные красители и полусинтетические антоцианы  значительно снижают острую токсичность  окислителя бихромата калия и гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

ЛИТЕРАТУРА

1.      Сизова Н.В. Биофлавоноиды - антиоксиданты, иммуномодуляторы, капиляропротекторы // Сырье и упаковка. - Вып.22. - N.5. - С.17-18.

2.      Costantini A., De Bemardi Т., Gotti A. Clinical and capillaroscopic evaluation of chronic uncomplicated venous insufficiency with procyanidins extracted from Vitis vinifera // Minerva Cardioangiol. - 1999. - V.47. - N.1-2. - P.39-46.

3.      Hou D.X., Ose Т., Lin S., Harazoro К., Imamura I., Kubo М., Uto Т., Terahara N., Yoshimoto М., Fujii М. Anthocyanidins induce apoptosis in human promyelocytic leukemia cells: structure-activity relationship and mechanisms involved // Int. J. Oncol. - 2003. - V.23. - N.3. - P.705-712.

4.      Cody V., Middleton E., Harbome J.B. Plant flavonoids in biology and medicine: biochemical, pharmacological, and structure-activity relationships. - New York: Alan. R. Liss. Inc., 1986. - 330 p.

5.      Fremont L., Belguendouz L., Delpal S. Antioxidant activity of resveratrol and alcohol-free wine polyphenols related to LDL oxidation and polyunsaturated fatty acid // Life Sci. - 1999. - V.64. - N.26. - P.2511-2521.

6.      Ray S.D., Kumar M.A., Bagchi D.A novel proanthocyanidin IH636 grape seed extract increases in vivo bcl-Xl expression and prevents acetaminophen-induced programmed and unprogrammed cell death in mouse liver // Arch. Biochem. Biophys. - 1999. - N.369. - P.42-58.

7.      Валуйко Г.Г. Биохимия и технология красного вина. - М: Пищевая промышленность, 1973. – c.295

8.      Бандюкова В.А., Шинкаренко А.Л. Тонкослойная хроматография флавоноидов. Методические рекомендации. - Пятигорск - 1975. 15 с.

9.      Валуйко Г.Г. Биохимия и технология красного вина. - М:. Пищевая промышленность, 1973. - 295 с

10. Барабой В.А., Биологическое действие растительных фенольных соединений. Наукова думка, Киев - 1976. – С. 163.

11. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г., Биол. мембраны, Т. 15(2) - 1998. - С. 137 - 167

12. Майер Ф. Естественные органические красящие вещества. – М.: Госхимиздат, 1940

13. Каррер П. Курс органической химии. – СПб.: Госхимиздат, 1962.

14. Губен Р. Методы органической химии, 3т., вып. 3 – М.: ОНТИ НКТП СССР, 1935.

15. РЖБиохим, 1965 10Ф958.

16. РЖХим, 1958, 28950; РЖХим, 1956, 43073.

17. РЖХимБх, 1957, 13444.

18. Galse Jeanne. Etude des leucoanthocyannes de la pomm et des boissons alimentaires qui en derivent// Bull. Soc. Pharmacy. Bordeaux. – 1964. – vol.103. - №2. – p.129-136

19. «Природа», 1959, №4, стр. 110-117.

20. Kloos Gustav. Über Beziehungen zwischen Eiweiβ- und Anthocyanogengenhalt in Gerste// Brauwissenschaft. – 1964. – vol.17 - №6. – p.214-215.

21. Биохимические методы анализа растений. Перевод с нем. А.Н. Бояркина. Под ред. И с предисловием Запрометова М.Н., М.: Изд-во иностранной литературы, 1960.

22. Вицнигер Р. Органические красители. М.: ОНТИ, 1936.

23. Ветчинкин А.Р. Естественные органические красящие вещества в пищевой промышленности. В сб.: «Зап. Сарат. план. ин-та», вып. 7, 1940, стр. 79-135.

24. Мачурин И.В. Итоги шестидесятилетних работ. Сельхозгиз, 1936.

25. Ветчинкин А.Р. Заменитель лакмуса. «Заводская лаборатория», 1952, №2

26. Хмелевская. Исследования по красителю красной капусты. Бюлл. Польск. АН», 1955, отд. 3, №10, стр. 523-525.

27. Степанов П.Ф. Новый краситель в гистологической технике. В «сб. работ по изучению нервной системы». Воронежск. Мед. Ин-т), 32 т. 1957 (1958), стр. 153-155.

28. Кротов Е.Г. Причины ухудшения цвета розового варенья при хранении. «Изв. Высш. Учеб заведений», 1960,»\№ 2, стр. 61-66.