Курсовая по микробиологии

     В ряде работ показано, что величины микробной массы, полученные методами прямой микроскопии и СИД тесно  и положительно коррелированны между  собой. Установлено также, что соотношения  грибы/бактерии, определяемые прямой микроскопией и селективным ингибированием СИД, были близки на растительных остатках и в почве. Однако некоторыми исследователями  отмечены и различия между величинами микробной биомассы почв, определяемыми  «непрямыми» и «прямыми» методами. Так, микробная биомасса, измеренная методом фумигации или СИД, была значительно больше, чем таковая  по прямой микроскопии. Другие авторы отмечают, что микробная биомасса, полученная фумигационным методом, была, напротив, меньше, чем прямым микроскопированием. В этих исследованиях прямое микроскопирование было выполнено преимущественно с применением агаровых или мембранных пленок, а окрашивание клеток – дианилином голубым, флюоресцин диацетатом или калькофлуором белым.

     Метод субстрат-индуцированного дыхания (физиологический метод), позволяющий оценивать содержание углерода микробной биомассы разных почв, широко применяется исследователями многих зарубежных стран.

     Навески почвы для определения субстрат-индуцированного дыхания и прямого микроскопирования были отбирают из предынкубированных образцов: до начала анализа почвы (0,5 кг) должны быть увлажнены до 50-60 % полной влагоемкости и проинкубированы при 22 °С в течение 7 сут в полиэтиленовых пакетах с воздухообменом.

     Субстрат-индуцированное дыхание (СИД) почвы оценивают по скорости начального максимального дыхания микроорганизмов после обогащения почвы дополнительным источником углерода и энергии (глюкоза). Навеску почвы (1 г) помещают во флакон (объемом 15 мл), добавляют раствор глюкозы (0,1 мл; результирующая концентрация 10 мг/л почвы), герметично закрывают и фиксируют время. Обогащенный образец почвы инкубируют (3-5 ч при 22°С), затем отбирают пробу воздуха из флакона и анализируют ее с помощью газового хроматографа. Время отбора газовой пробы также фиксируют. Предварительные эксперименты показали, что внесено 10 мл глюкозы на 1 г исследуемых почв обеспечило наибольшую скорость СИД за 4 ч их инкубации. Скорость СИД выражали в мкг СО₂-С г^-1 сухой почвы ч^-1.

     Микробную биомассу рассчитывают по формуле : 

     С_мик(мкг С г^-1 почвы) = (мкл СО₂ г^-1 сухой почвы ч^-1)40,04 + 0,37. 

     Базальное дыхание определяется как среднее потребление кислорода (мкл или О₂ г^-1 час^-1) субстратом без добавления глюкозы. 

     1.3.2 Определение поглощения  О₂ [9]

     Для определения биологической активности почвы применяют метод Варбурга, позволяющий измерять не только выделение О₂, но и поглощение О₂ исследуемыми образцами. Продуцируемый микрофлорой и мнкрофауной СО₂ выделяется из почвы лишь частично, поскольку некоторую его часть утилизуют автотрофные бактерии и водоросли. В связи с этим сопоставление уровней продуцирования СО₂ и утилизации кислорода может значительно обогатить познания в области газообмена почв. Метод Варбурга позволяет получать очень точные данные, но его недостаток заключается в том, что респирационные сосуды малы и поэтому показатели поглощения О₂, измеренные на образце почвы массой в несколько граммов, нельзя экстраполировать на значительные площади. Данные, полученные методом Варбурга, обычно отражают результаты очень кратковременных исследований (1-2 часа), хотя в последнее время публикуется все больше сообщений о результатах более длительных исследований, выполненных этим же методом.

     Исследование  выполняют следующим образом: очищенную от корней и прочих растительных материалов сухую почву просеивают через сито с ячеями размером 1 мм и увлажняют до 60% от полной влагоемкости почвы. В отдельные сосуды аппарата Варбурга помещают по 4 г почвы, а в маленькую емкость для щелочи, расположенную в средней части этих сосудов, вносят 0,2 мл 20%-ного раствора КОН. Притертые части респирационных сосудов и манометров смазывают силиконовым маслом и устанавливают манометры. Сосуды должны быть полностью погружены в нагретую до 25 °С воду. Постоянную температуру поддерживают с помощью регулятора, соединенного контактным термометром, и мотора. В течение 30 минут, когда почва нагревается до температуры водяной бани, манометры остаются открытыми. Затем с помощью винтов уровень жидкости манометра устанавливают на деление шкалы, отмеченной числом 150. Кран перекрывают и в открытой половине трубки манометра считывают высоту уровня жидкости Бродье. Далее включают двигатель аппарата Варбурга и начинают измерение.

     Частоту взятия отсчетов выбирают в зависимости  от интенсивности дыхания субстрата; например, показания манометра можно  считывать через 10, 15, 30 или 40 минут.

     В том случае, если субстрат потребляет кислород, давление падает и уровень жидкости в закрытой половине трубки манометра повышается; показания манометра считывают при выключенном двигателе. Уровень жидкости в закрытой части трубки устанавливают па деление шкалы, отмеченное числом 150, и считывают показание по открытой трубке манометра.

     Если  через каждые 30 минут показания  открытой трубки манометра составляют последовательно 125, 103 и 78 мм, а исходное положение соответствовало 150 мм, то в этом случае измерение уровня в отдельные периоды составляло минус 25, минус 22 и минус 25 мм, а общее изменение равно 72 мм.

     Однако  в процессе измерения атмосферное  давление и температуры водяной  бани могут измениться, и это может  служить, источником ошибок. Такие колебания  корректируют по показаниям термобарометра. В качестве термобарометра используют один из манометров и инкубационных  сосудов аппарата Варбурга. При измерении дыхания почвы в сосуд термобарометра также вносят 4 г предварительно стерилизованной увлажненной почвы. В центральную емкость наливают раствор КОН, однако в этом случае потребления кислорода не будет, так как биологические процессы в системе не протекают. Все измерения с помощью термобарометра проводят, как описано выше.

     Некоторые исследователи считают целесообразным перед началом измерении в течение 16-20 часов выдерживать почву на водяной бане. В этом случае разброс показателей потребления О₂ будет менее значительным.

     Как уже отмечалось выше, один из недостатков  метода состоит в том, что респирационные сосуды имеют небольшие размеры и поэтому пригодны для исследования весьма малых (4 г) образцов почвы. Для устранения этого недостатка некоторые авторы применяли сосуды большого объема, вмещающие 20-25 г почвы. В результате возрастает степень надежности исследования. При работе с такими сосудами необходимо более часто снимать показания манометра. 

     1.3.3 Определение выделения  СО₂ [6]

     Углекислый  газ в почве является продуктом  жизнедеятельности ее живого населения. Он образуется в процессе минерализации  почвенной биотой органических веществ. Интенсивность выделения почвой СO₂ косвенно свидетельствует об активности жизнедеятельности биоты. В работе B.Н. Мина проведен анализ наиболее часто используемых методов определения интенсивности дыхания почвы. Большинство из них основано на том, что определенный участок почвы, лишенный растительности, или исследуемую навеску почвы изолируют от атмосферного воздуха камерой-изолятором. Выделяющуюся из почвы в камеру углекислоту учитывают количественно.

     Метод обогащения

     Камеру-изолятор экспонируют на поверхности почвы определенное время, после чего из нее берут пробу обогащенного углекислотой воздуха, в которой определяют содержание СО₂. Следует учитывать, что интенсивность выделения углекислого газа зависит от градиента его концентраций в почве и атмосфере. При накоплении СО₂ в камере-изоляторе происходит падение градиента концентраций, что приводит к ошибке в определении интенсивности дыхания почвы. Однако подбором размеров камеры и времени экспозиции эту ошибку можно уменьшить до минимальных значений.

     Метод Б.Н. Макарова

     Наиболее  употребляемым для определения интенсивности дыхания по методу обогащения считается метод Макарова, согласно которому объем камеры-изолятора составляет 83 дм³ (28х58х51). Камеру-домик экспонируют 20-30 мин на почве, затем отсасывают пробу воздуха (~ 2 л) для анализа.

     Объем пробы для анализа составляет 2 л. Пробу пропускают через титрованный раствор барита, помещенный в поглотитель Рихтера. Остаток свободной щелочи определяют титрованием соляной кислотой в присутствии фенолфталеина. Уровень барита, связавшегося с углекислотой, рассчитывают по разности между количеством, взятым для поглощения и оставшимся свободным.

     Начальную концентрацию СО₂ в атмосфере определяют путем протягивания такого же, как и в опыте, объема воздуха из слоя на высоте 30-40 см. Интенсивность выделения СО₂ почвой вычисляют как разность между расходом барита на СО₂ перед и после экспозиции. Использование для анализа проб воздуха газового анализатора позволяет уменьшить пробу до 1-2 мл, что не оказывает существенного влияния па изменение его объема в камере.

     Упрощенный  метод определения дыхания почвы  по Б.Н Макарову

     Модифицированный  метод состоит в том, что на поверхности почвы ставится широкогорлая (диаметр 5 см) колба на 1-1,2 л, края которой обернуты фильтровальной бумагой. После экспозиции 20-30 мин колбу снимают и плотно закрывают каучуковой пробкой. Через это отверстие в колбу пипеткой вводят 25-50 мл 0,02 н. раствора Ва(ОН)₂ для поглощения СО₂, после чего отверстие закрывают. Барит в колбе интенсивно взбалтывают 5 мин.

     Затем избыток барита оттитровывают по фенолфталеину 0,02 н. раствором НС1. Параллельно определяют содержание СО₂ в воздухе. По разнице между уровнем СО₂ в колбе после экспозиции ее над почвой и контролем (в воздухе) рассчитывают количество выделившейся почвой углекислоты (пересчет на 1 м² или на 1 га/ч).

     Метод протягивания воздуха

     Через камеру пропускается воздух, и углекислота, выделенная почвой, увлекается вместе с ним. Оптимальна такая скорость протока, при которой скорость выделения СО₂ будет равна скорости его образования. Однако ток воздуха и раздражение, создаваемое им, будут нарушать естественную интенсивность дыхания почвы, что повлечет дополнительное извлечение из нее углекислого газа.

     Метод адсорбции

     Углекислота, выделяемая почвой, поглощается раствором  щелочи, помещенной в изолирующую  камеру. При этом большое влияние  на результаты определений оказывают  такие условия эксперимента, как отношение площади поглотителя к изолируемой площади почвы, концентрация и количество поглощающего щелочного раствора, температура и объем изолятора. Расчеты В. Н. Мина показывают, что отношение площадей изолятора и поглотителя, при котором исходный градиент концентрации СО₂ во время определения не будет нарушен, должно быть равно 6,0. Так, при интенсивности дыхания 0,08 мг/(см²×ч) поверхность поглощения должна составлять 32-35 % изолированной площади почвы. Это предусмотрено в методике В. И. Штатнова, где при изолируемой площади почвы 200 см² поглотитель – чашка Петри диаметром 10 см – составляет 36 % площади изоляции.

     Метод И.Н. Шаркова

     Исследования  И. Н. Шаркова показали, что погрешности измерения скорости продуцирования СО₂ почвой обусловлены в основном нарушением исходного градиента концентрации углекислого газа в системе почвенный воздух – подпочвенный воздух. В герметичной камере нарушенный градиент через определенный промежуток времени (переходный период) восстанавливается. Поэтому при проведении измерений в полевых условиях необходимо большое заглубление сосудов в почву и удлинение сроков их экспозиции. Готовят тонкостенные дюралевые сосуды диаметром 10 и высотой 25 см с заостренным нижним краем и крышками с обоих концов. Путем осторожного врезания в почву на глубину 20 см в эти сосуды в полевых условиях берут почвенные монолиты ненарушенного сложения. Затем на нижний край сосудов надевают крышки и доставляют их в лабораторию. Измерение скорости выделения СО₂ из почвы проводят при естественной влажности образцов и температуре 20 °С. В полевых условиях используют эти же дюралевые сосуды, но без нижних крышек. Перед измерением скорости выделения СО₂ сосуды врезают в почву на определенную глубину.

     Для определения скорости выделения  СО₂ в лабораторных и полевых условиях на поверхность почвы ставят чашку диаметром 4,5-5 см с 10 мл 0,4-0,5 н. NaOH. Сосуды закрывают крышкой. После экспозиции (24 ч) остаток щелочи оттитровывают 0,1 н. H₂SО₄ до рН 8,4 с помощью блока автоматического титрования БАТ-15. Контролем служит вариант, в котором щелочь на период экспозиции помещают в такой же сосуд, как опытный, но без почвы.

     Расчет  выделившегося СО₂ проводят по формуле: 

                                                                  ×                                                               (11)