Биотехнология в молочном скотоводстве

На 60-90 день после пересадки  зародышей животных исследуют на стельность методом ректальной пальпации.

 

 

Таблица 5

Приживляемость эмбрионов в зависимости от используемого препарата.

Показатели	Группы
	I	II	III
	контроль	ханегиф	ханегиф + аминазин
Число эмбриопересадок, n	100	100	120
Число стельных реципиентов, n	47	55	77
Процент стельности	47,0	55,0	64,0

Результаты проведенных  опытов показывают, что применение ханегифа при пересадке эмбрионов повышает их приживляемость до 55%, а комплексное использование ханегифа и аменазина до 64%.

Необходимость быстрого увеличения количества высокоценных в племенном  отношении животных дала толчок к  поискам новых способов размножения, позволяющих получать относительно однородный в генетическом плане  материал.

Используя метод микрохирургического  деления эмбрионов, представляется возможность повышения эффективности трансплантации эмбрионов за счет увеличения эмбриоматериала, получения клонов генетически идентичных животных с заданными хозяйственно-полезными признаками и желаемого пола.

Для деления отбираются эмбрионы только хорошего или отличного качества на стадии поздней морулы или бластоцисты, как свежеполученные, так и замороженно-оттаянные.

Микроманипуляции на эмбрионах проводятся с помощью микроманипулятора ПМ-2 или манипулятора французской фирмы “JMV” марки REF-4080 в чашке Петри под инвертируемым микроскопом “Labovert” или стереомикроскопом “Nikon”.

В качестве рабочего инструмента  для деления используется стеклянная микропипетка-игла, изготавливаемая из стандартных капилляров с внутренним диаметром 0,8 мм и внешним 1,2 мм на пуллере отечественного производства по методу Никитина В.А. Оптимальными являются следующие размеры: длина плеча 2,5 мм, конусная часть - 10 мм.

Перед началом работы приготавливаются рабочие среды. Среда на основе фосфатно-солевого раствора Дюльбекко с добавлением 20% эмбриональной сыворотки и антибиотиков (100 ед/мл ампициллина и 12 мкг/мл гентамицина) используется для деления зародышей. Культивирование половинок проводят в среде ТС-199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки, антибиотиков (100 ед/мл ампициллина и 12 мкг/мл гентамицина), лактата кальция (0,6 мг/мл), пирувата натрия (0,2 мг/мл) и глютамина (0,15 мг/мл).

Деление эмбрионов осуществляют следующим образом. После оценки пригодные для микрохирургии  зародыши переносятся в среду  Дюльбекко. Затем клетка в капельке среды помещается на подготовленную чашку Петри над штрихами. Над ней размещают нож таким образом, чтобы плечо ножа не касалось чашки. Угол наклона ножа составляет 5° -25° к рабочей поверхности. Эмбрионы рассекаются опусканием ножа в медиальную плоскость клетки, одновременно разделяя оболочку и внутреннюю клеточную массу. При делении бластоцист необходимо разделять как эмбриобласт, так и трофобласт строго по середине. При проведении микрохирургической операции соблюдаются следующие правила: 1 - микроигла на эмбрион опускается постепенно, с паузами (нажим, пауза, нажим, пауза и т.д.); 2 - после начала деления нельзя резко поднимать нож, т.к. клетка находится в напряженном состоянии и резкое поднятие ножа вызывает отрицательное давление, что приводит к гибели клетки. Эмбрионы делят двумя методами. В первом случае эмбрионы рассекаются полностью, полученные половинки в дополнительные зоны пеллюцида не пересаживаются. Во втором случае деление прозрачной оболочки проводится частично, а внутренняя клеточная масса делится полностью. Полученные полуэмбрионы остаются в собственной оболочке. Критерием успешного деления считают минимальное повреждение бластомеров и получение симметричных половин.

Затем полуэмбрионы переносятся в среду для культивирования и помещаются в термостат при температуре +38° С во влажную атмосферу, содержащую 5% СО2 на 0,5-24 часа. Если в результате культивирования эмбрионы округлились, приняв обычную форму, считается, что деление прошло успешно. Их заправляют в пайетты и пересаживают реципиентам.

В ходе научно-производственных опытов нами установлено, что эффективность  микрохирургического деления эмбрионов  зависит, прежде всего, от метода деления, а также от способа их трансплантации реципиентам.

Таблица 6

Влияние метода деления на приживляемость половинок эмбрионов.

Показатели	Методы деления
	Полное разделение эмбрионов без помещения в  свободные зоны пеллюцида	Частичное разделение эмбрионов, половинки оставались в  свободной оболочке
Разделено эмбрионов, n	27	28
Получено половинок, n	49	51
Процент от разделенных	90,7	91,1
Пересажено половинок, n	47	48
Использовано реципиентов, n	34	24
Стельных реципиентов, n	15	14
Процент от числа используемых реципиентов	44,1	58,3

При делении зародышей  на две части и без переноса половинок в свободные зоны пеллюцида продолжили свое развитие 90,7% полуэмбрионов, а их приживляемость была на уровне 44,1% (табл. 6). В случае, если проводили частичное разделение эмбрионов, а половинки оставляли в свободной оболочке, то сохранность деми-эмбрионов составила 91,1%, а приживляемость повысилась до 58,3%.

Было установлено, что  при ипсилатеральной пересадке одного полуэмбриона стельными стали 38,1% животных, в то время как при той же пересадке двух полуэмбрионов одному реципиенту этот показатель составил58,3% (табл. 7).

Таблица 7

Приживляемость полуэмбрионов крупного рогатого скота в зависимости от метода их пересадки.

Показатели	Способ пересадки
	Ипсилатерально		Билатерально
	Два полуэмбриона в один рог матки	Один полуэмбрион в один рог матки	Два полуэмбриона в разные рога матки
Количество интактных эмбрионов, n	28	12	15
Получено половинок, n	51	21	28
Процент от разделенных	91,1	87,5	93,3
Пересажено половинок, n	48	21	26
Использовано реципиентов, n	24	21	13
Стельных реципиентов, n	14	8	7
в т. ч двойнями	6	-	3
Процент от числа использованных	58,3	38,1	53,8
Учтено отелов, n	3	3	2
Получено телят, всего	5	3	2
в т.ч. двойни	4	-
одинцы	1	3	2

Билатеральная пересадка  двух полуэмбрионов обеспечила 53,8% стельности.

Таким образом, лучшие результаты были получены при пересадке одновременно двух половинок эмбрионов как  ипсилатерально, так и билатерально. Относительно невысокий уровень приживляемости (38,1%) при пересадке одного полуэмбриона доказывает, что эффективность приживляемости половинок зависит и от сигнала “эмбрион-реципиент”, с усилением которого повышается и уровень приживляемости деми-эмбрионов.

9.Криоконсервирование эмбрионов.

Использование технологии криоконсервирования зародышей позволяет сохранить ценный эмбриоматериал при отсутствии животных-реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью.

Технология глубокого  замораживания и оттаивания зародышей  предусматривает следующие этапы: выбор криопротектора и приготовление криозащитных растворов; качественная оценка зародышей, насыщение их криопротектором; постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей; перенос эмбрионов в жидкий азот и их хранение; оттаивание при определенной температуре; выведение криопротектора из эмбриона; морфологическая оценка зародышей на пригодность к трансплантации.

Для криоконсервирования используют свежеполученные эмбрионы только отличного и хорошего качества. Основным условием при этом является сокращение до минимума времени манипуляций с эмбрионами от момента извлечения до замораживания.

Операции по подготовке зародышей  к криоконсервированию (оценка их жизнеспособности, насыщение эмбрионов криопротектором, заправка в пайетты) проводят в стерильном боксе. Посудой для проводки эмбрионов служат стерильные часовые стекла с лунками и чашки Петри.

Наиболее эффективно замораживание  поздних морул и ранних бластоцист. В качестве криопротекторов используют 1,4 М (10%) раствор глицерина и 1,5 М этиленгликоль.

Основой для приготовления  рабочих растворов криопротекторов является среда Дюльбекко, содержащая 100 ед/мл ампициллина и 12,0 мкг/мл гентамицина и 20% фетальной сыворотки теленка. Насыщение эмбрионов глицерином осуществляется поэтапно в возрастающих концентрациях растворов (0,35 М; 0,7 М; 1,05 М; 1,4 М). Проводка осуществляется в стеклах с лунками с экспозицией по 5 минут в первых трех концентрациях глицерина и 10 минут в 1,4 М раствора.

Насыщение эмбрионов 1,5 М  раствором этиленгликоля проводится одноступенчато с выдержкой 10 минут. После выдержки в последнем растворе криопротектора эмбрионы с помощью микроаспиратора помещают в пайетты (не более 2 зародышей). Нижний конец пайетты закрывают пластиковой пробкой, на которой указывают дату извлечения, номер донора и номер пайетты.

Для замораживания эмбрионов  используют программные замораживатели: ЗЭМ-4 (Украина), Миникул АС-25 (Франция), ЗМБИ-К (Россия).

Пайетты с эмбриоматериалом переносят в камеру для замораживания и включают программу. Снижение температуры происходит автоматически до заданного программного уровня. Затем пайетты переносят в жидкий азот для хранения.

Хранение замороженных эмбрионов  осуществляется непосредственно в  жидком азоте, в сосуде Дьюара. Используются стандартные канистры для хранения гранул спермы. Для транспортировки эмбрионов в замороженном состоянии применяют сосуд Дьюара емкостью 5 л с аналогичными канистрами.

Оттаивание пайетт с замороженными эмбрионами можно проводить одним из двух способов. Первый – в водяной бане при +37°С в течение 10 секунд; второй – оттаивание вначале на воздухе при +20-22°С в течение 10 секунд, затем в водяной бане при +25°С также 10 секунд. Затем пайетту освобождают от маркерной пробки, конец с пыжом отрезают и содержимое помещают на часовое стекло. Под микроскопом проводят подсчет количества оттаянных эмбрионов и предварительную морфологическую оценку. После этого эмбрионы отмывают от криопротектора.

Удаление криопротектора глицерина осуществляется в обратной последовательности (1,05 М; 0,7М; 0,35М) с выдержкой по 5 минут в каждом из растворов. Эмбрионы после проводки помещают в 20% эмбриональную сыворотку и ставят в термостат при +37°С на кратковременное культивирование (до 1 часа).

Зародыши, замороженные в 1,5М  растворе этиленгликоля, после оттаивания также помещают в 20% эмбриональную  сыворотку и культивируют. Затем  проводят заключительную морфологическую  оценку под микроскопом. Жизнеспособные зародыши заправляют в пайетты и пересаживают реципиентам.

Проведенные нами исследования по использованию 1,4М раствора глицерина  и 1,5М этиленгликоля показали высокие  результаты сохранности и приживляемости замороженно-оттаянных зародышей (табл. 8).

Однако, одноступенчатый  способ насыщения зародышей 1,5М раствором  этиленгликоля позволяет сократить  в 2–2,5 раза затраты рабочего времени  при манипуляциях с эмбрионами по сравнению с четырехступенчатым насыщением зародышей 1,4М раствором  глицерина.

 

 

Таблица 8

Приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов в зависимости от используемого криопротектора и способа насыщения.

Показатели	Криопротекторы
	1,4М р-р глицерина	1,5М р-р этиленгиколя
Заморожено эмбрионов, n	64	55
Оттаяно эмбрионов, n	53	49
Жизнеспособных эмбрионов, n	46	44
Процент сохранности	86,8	89,7
Пересажено эмбрионов, n	41	43
Стельных реципиентов, n/%	20/48,7	21/51,2
Затрачено времени при  манипуляции с эмбрионами, мин.	25	10