Иммунологические методы диагностики

В блоке обработки поступающие  от детектора сигналы усиливаются  и сравниваются на основе выбранных критериев с заданными параметрами. Эта операция позволяет определять, является ли регистрируемое событие тем, которое нас интересует. Выбор интересующих нас событий называется дискриминацией, а ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр, — окнами. Выбор окон — одна из важнейших операций при работе специалиста на цитометре. Включение определенных субпопуляций в анализ и исключение их из него существенно влияют на результаты анализа образцов и зависят от профессионализма специалиста. Из блока обработки сигналы посылаются в блок хранения компьютера. Обычно данные представляют в виде распределений частот встречаемости одного или двух параметров. Эти распределения называют гистограммами, или профилями.

Критическим моментом для адекватного  использования цитометра является выбор флуорохрома. Идеальный флуорохром должен обладать следующими свойствами:

1) возбуждаться при нужной длине  волны: для цитометра»FacScan» длина  волны возбуждения аргонового  лазера составляет 488 нм;

2) легко связываться с белками;

3) обладать низким уровнем неспецифического  связывания окрашивания;

4) отдавать энергию возбуждения  в виде флуоресценции, т.е. иметь  высокий квантовый выход;

5) излучение флуорохрома должно  лежать в зоне максимальной  чувствительности фотодетектора;

6) длины волн излучаемого флуорохромом  света не должны совпадать  с длинами волн аутофлуоресценции  (флуоресценции молекул, присутствующих  в анализируемых клетках, но  не имеющих отношения к флуорохрому);

7) допускать использование в  одном опыте данного флуорохрома одновременно с другими.

Стандартным флуорохромом, применяемым  в проточной цитометрии, стал флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), излучающий в зеленой части спектра. Другая удачная находка — флуорохром фико-эритрин, который возбуждается светом той же длины волны, что и ФИТЦ, но излучает в красной части спектра. Это дало возможность применять его в паре с ФИТЦ при «двойном окрашивании».

 

 

 

Клиническое значение результатов исследования иммунного статуса

 

Главными задачами при оценке иммунного  статуса являются иммунодиагностика нарушений иммунной системы, прогнозирование тяжести патологического процесса, оценка эффективности проводимого лечения и профилактика.

Идентификация нарушенного звена  иммунной системы дает возможность  подтвердить (или отклонить) клинический диагноз.

Выделяют клинические признаки иммунологической недостаточности, которые  включают 4 основных синдрома:

1) инфекционный синдром (рецидивирующие, хронические инфекции);

2) аллергический синдром;

3) аутоиммунный синдром;

4) иммунопролиферативный синдром.

Иммунодиагностика при перечисленных  синдромах имеет значение для  изучения этиопатогенеза заболевания, прогнозирования обострения, для  выбора метода лечения и оценки его  эффективности.

Методы иммунодиагностики можно  разделить на скрининговые и уточняющие. Первые существуют для фиксирования нарушений в иммунной системе, вторые — для установления механизмов, задействованных в их реализации с целью дальнейшей иммунокоррекции.

Стандартный скрининговый тест включает:

• подсчет абсолютного количества лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов;

• определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов различных классов (IgG, IgA и IgM);

• определение гемолитической активности системы комплемента CH₅₀;

• проведение кожных тестов гиперчувствительности  замедленного типа.

Гематологический анализатор-автомат (рис. 24) предназначен для:

 

 

Рис. 24. Coulter MAXM — настольный автоматический гематологический анализатор на 26 параметров (существует вариант  для ветеринарии)

 

 

• измерения параметров классической гемограммы;

• дифференциального анализа пяти популяций лейкоцитов;

• гистограммы распределения эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов;

• диаграммы лазерного лейкоцитарного анализа (индикация патологии);

• определения количества ретикулоцитов, их объема и показателя зрелости.

Более детальное изучение иммунного  статуса включает изучение количества и функциональной активности клеточного и гуморального звеньев иммунной системы:

• Исследование фагоцитарной функции.

• Исследование системы комплемента.

• Исследование Т-системы иммунитета.

• Исследование В-системы иммунитета.

Рациональным считается исследование иммунного статуса в несколько  этапов. Вначале проводятся ориентировочные  исследования для выявления значительных дефектов иммунной системы (1-й уровень), затем можно провести более подробное изучение (2-й уровень) основываясь на данных предыдущего исследования.

Тесты 1-го уровня:

• Исследование фагоцитарной функции:

– подсчет абсолютного числа  фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов);

– оценка интенсивности поглощения микробов фагоцитами;

– способности фагоцитирующих клеток переваривать захваченные микробы.

• Исследование система комплемента:

– определение гемолитической активности комплемента CH₅₀.

• Исследование Т-системы иммунитета:

– подсчет общего числа лимфоцитов;

– подсчет процента и абсолютного  числа зрелых T-лимфоцитов (CD₃) и двух основных их субпопуляций: хелперов/индукторов (CD₄) и киллеров/супрессоров (CD₈);

– определение пролиферативного ответа на основные T-митогены (фитогемагглютинин  и конканавалин A).

• Исследование В-системы иммунитета:

– определение концентрации иммуноглобулинов различных классов (G, A, M, E) в сыворотке  крови;

– определение процента и абсолютного  количества B-лимфоцитов (CD19, СD20) в периферической крови.

Тесты 2-го уровня:

• Исследование фагоцитарной функции:

– оценка интенсивности хемотаксиса  фагоцитов;

– определение экспрессии молекул  адгезии (CD11a, CD11b, CD11c, CD18) на поверхностной  мембране нейтрофилов.

• Исследование Т-системы иммунитета:

– исследование продукции цитокинов (интерлейкина-2 (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6; гамма-интерферона (ИФН-γ); фактора некроза опухоли (ФНО α));

– определение активационных молекул  на поверхностной мембране T-лимфоцитов (CD25, HLA-DR);

– выявление молекул адгезии (CD11a, CD18);

– исследование пролиферативного ответа на специфические антигены, чаще всего на дифтерийный и столбнячный анатоксины;

– проведение аллергической реакции  с помощью кожных тестов с рядом  микробных антигенов.

• Исследование В-системы иммунитета:

– субклассов иммуноглобулинов, особенно IgG;

– секреторного IgA;

– исследование соотношения κ (каппа) и λ (лямбда) цепей иммуноглобулинов;

– определение специфических антител  к белковым и полисахаридным антигенам;

– исследование способности лимфоцитов к пролиферативному ответу на митогены B(стафилококк, липополисахарид энтеробактерий) и T-B (митоген лаконоса).

 

Определение чувствительности к иммуномодуляторам

 

До клинического применения иммуномодуляторов  предварительная оценка индивидуальной чувствительности организма к ним  оказывается существенно эффективной. Действие иммуномодуляторов определяется особенностями иммунной системы, в частности взаимосвязанным и взаимозависимым функционированием клеточных элементов, участвующих в развитии иммунного ответа.

Крайне важным подходом к назначению иммунокорректоров является предварительное вычленение основного пораженного звена иммунитета и адресная доставка иммуномодуляторов, ибо в противном случае применение иммуномодулирующих средств может быть неэффективным.

Разработка новых подходов к  оценке иммуномодулирующей эффективности новых препаратов положительным образом сказывается на развитии клинической иммунологии и создании новых методов определения состояния иммунной системы человека и показаний для назначения иммуномодулирующих средств и контроля за проводимой терапией.

 

Глава 4. Гибридомная технология. Получение и использование моноклональных антител

 

Термины

АОК  — антителообразующая клетка; плазматическая клетка; зрелый В-лимфоцит.

ГАТ — питательная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин.

ГГФРТ — фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза. Катализирует синтез нуклеотидов.

ДМЕМ — питательная среда Игла специальная.

ДМСО — диметилсульфоксид. Стабилизатор.

ПЭГ — полиэтиленгликоль.

Фидер — вспомогательная культура клеток, выполняющая функции по детоксикации среды и подкормки основной культуры клеток.

ФСТ  — фетальная сыворотка теленка.

 

Гибридомную технологию с полным правом можно назвать методом иммунобиотехнологии  с очень широким диапазоном применения: от диагностики и лечения заболеваний разной этиологии до судебной экспертизы. В ветеринарной практике данный метод с успехом применяется для получения моноклональных антител, уникальная структура которых как раз позволяет проводить точную специфическую диагностику болезней, вызванных инфекционными агентами.

В представленном методическом пособии изложен общий иммунобиотехнологический принцип получения гибридом, способных секретировать специфические антитела заданной направленности.

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) — в крови появляются защитные белки — антитела, для которых характерна необыкновенная, уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6–8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сот аминокислот, имеется несколько (от 5 до 15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. То же относится и к поли-сахаридным антигенам, детерминантные группы которых образуются 3–6 остатками моносахаридов.

Таким образом, при введении антигена возникает большое семейство  антител, направленных к разным его  детерминантам. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

Однако иногда требуются не многокомпонентные  смеси антител, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Но получить такие антитела путем иммунизации невозможно по причине образования большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество генетически однородных семейств клеток-клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам (в этом, кстати, суть клонально-селекционной теории Бернета).

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны АОК в пробирке — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, т.е. антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

 

Гибридомы

В 1975 г. иммунологи Георг Келер и  Цезарь Мильштейн разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить.

Методы гибридизации соматических (т.е. не половых) клеток к тому времени  были хорошо известны и широко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двухъядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридома. Гибридому можно получить и между нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки. Весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить образовавшуюся гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые.

Для достижения этой цели авторы разработали  специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего, был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которой можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеется два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот. Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот; гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.