Иммунологические методы диагностики

 

Применение  ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминология. ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (genetic fingerprint).

Установление отцовства. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных, бактериальных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Высокие показатели чувствительности и специфичности полимеразной цепной реакции (ПЦР) делают ее революционной  в лабораторной диагностике. Показания  к применению ПЦР такие же, как  и у культурального метода. Следует  учитывать, что при исследовании биопроб методом ПЦР сразу после курса антибактериального лечения в некоторых случаях можно получить «ложноположительные с клинической точки зрения» результаты, поскольку невозможно однозначно оценить жизнеспособность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только молекулярно-биологические методы, поскольку амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.

Метод ПЦР особенно эффективен при  выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Диагностические возможности ПЦР  не ограничены способностью микроорганизма расти на искусственных средах или  в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой  чувствительности ПЦР-метода (поскольку их чувствительность сопоставима), а в способности идентифицировать, определять свойства и работать с большим разнообразием микроорганизмов, которые не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

 

Преимущества  ПЦР как метода диагностики

Одним из важнейших критериев диагностической  эффективности любого лабораторного  анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов, г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую нуклеиновую кислоту (НК), если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем: диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности — «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные  результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99–100 %.

Диагностическая чувствительность и  специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом»  в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм.

Проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые», или экспресс-тесты имеют чувствительность 40–60 %, ИФА — 50–70 %, прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) — 55-75%, культуральное исследование — 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Поэтому ПЦР по сравнению с другими  способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты  позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

• Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

• Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

• Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять единичные копии в исследуемом образце.

• Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

• Возможность доклинической  и ретроспективной диагностики  ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. в серонегативной фазе, или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

• Проведение анализа  возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

• Возможность одновременной  диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

• Возможность экспертизы — полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства  метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

Ошибки при  использовании метода ПЦР

С точки зрения получения ложноотрицательного  или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых  невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии «положительной» ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные «положительной» ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической  стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.

Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа  с результатами других исследований, например с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА). Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. При хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией, такая картина бывает нередко.

 

 

 

Глава 3. Методы изучения иммунного статуса организма

Определение антителопродуцирующих клеток

Антителопродуцирующие клетки определяют при помощи меченых антител или антигенов. В первом случае наиболее популярным является сэндвич-тест (англ. sandwich — многослойный), смысл которого сводится к последовательному нанесению на мазок-отпечаток или срез лимфоидной ткани сначала взвеси или раствора соответствующего антигена, а затем гомологичной им меченой флуорохромом антисыворотки (МФА). Светящийся антиген локализуется на клетках, продуцирующих антитела, высвечивая их контуры.

Если нужно обнаружить не антитело, а иммуноглобулинпродуцирующие клетки, используют прямой и непрямой варианты МФА с применением меченой антивидовой сыворотки ко всем глобулинам или к иммуноглобулинам определенного класса.

В экспериментальных исследованиях  на линейных мышах и крысах для  оценки первичного (IgM и IgG) и вторичного (IgG) ответа на тимус-зависимый или тимус-независмый антиген используется метод определения количества антителообразующих клеток in vivo в камере (или агаре) по Cunningham.

 

Первичный (IgM) гуморальный иммунный ответ in vivo

Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса IgM (IgM-АОК) в селезенке мышей, оценивается на пике иммунного ответа на 4-5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 10⁷ ЭБ/мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом. У мышей после шейной дислокации извлекается селезенка и помещается в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждая селезенка помещается в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводятся на льду. Объем клеточной суспензии доводится до 5 мл; клетки разводятся средой до необходимой концентрации. Затем готовится инкубационная смесь: 300 мкл среды, 100 мкл суспензии ЭБ (4·10⁹ ЭБ/мл), 100 мкл сыворотки морской свинки, предварительно разведенной в 1,5 раза и 500 мкл клеточной суспензии. Компоненты перемешиваются и смесь заливается в стеклянные камеры (по 2 камеры на каждое животное, учитывая среднее), сделанные из двух предметных стекол, склеенных смесью воска с парафином вдоль продольных сторон. Учитывается объем камеры. Камеры помещаются в термостат и инкубируются 90 мин. при +38 °C. После инкубации подсчитываются зоны гемолиза под бинокулярной лупой (×42):

 

N АОК = n АОК в камере × Объем клет. суспензии × Разведение клеток.

Объем камеры

 

 

Вторичный IgG ответ in vivo

Первичная иммунизация проводится внутривенно в дозе 2 % ЭБ в объеме 0,5 мл. Через 30 дней после первичной иммунизации проводится вторичная иммунизация ЭБ в дозе 10·10⁶/мышь внутривенно. Количество IgG АОК определяется в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза. Клетки селезенки инкубируются 2 часа при 39 °C в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитываются под увеличением ×42. Результаты выражаются в абсолютном количестве IgG АОК в селезенке.

 

Продукция IgG В-клетками in vitro

Продукцию IgG клетками селезенки и  костного мозга, спонтанную и LPS-стимулированную, определяют в супернатантах клеточных культур после культивирования в течение 7 дней. Оптимальная доза LPS E. coli, установленная в предварительных опытах, составляет 30 мкг/мл. Результаты выражают в мкг/мл и индексах стимуляции (IS — отношение разницы между опытом и контролем к контролю).

Концентрацию IgG в периферической крови и супернатантах культур  определяют твердофазным вариантом  метода иммуноферментного анализа  в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы E.I.A. «Linbro» с помощью меченного пероксидазой хрена конъюгата и ОФД в качестве субстрата. В качестве основного буфера используется Tris-NaCl, блокирующего агента — желатин.

Также предварительно должны быть определены оптимальные разведения конъюгатов и антисывороток. Интенсивность реакции оценивают на многоканальном спектрофотометре Multiskan при l = 492 нм. Калибровочную кривую строят по препаратам IgG (Sigma) (10–100 нг/мл). Результаты выражают в абсолютных значениях (мг/мл, мкг/мл).

 

 

 

Оценка клеточного звена иммунной системы

 

Т-лимфоциты — самая многочисленная (60 %) популяция клеток иммунной системы (ИС), которая в свою очередь разделяется на субпопуляции. Хелперы и супрессоры являются иммунорегуляторными клетками, а киллеры и эффекторы ГЗТ — эффекторными (рис. 15).

 

 

Рис. 15. Взаимодействие Т-лимфоцитов

 

 

Т-киллеры разрушают инфицированные клетки и клетки опухолей. Существует еще субпопуляция так называемых естественных киллеров (ЕК), они имеют CD56/57+. Это большие гранулярные  клетки, в гранулах содержится белок  перфорин, который может проникать  в мембрану клетки-мишени и в результате полимеризации образовывать мембраноатакующий комплекс (своеобразная «дырка» в мембране), вызывая осмотический «взрыв» и лизис клетки.

Клеточный иммунный ответ разделяют  на стадии: