Иммунологические методы диагностики

 

 

Пластины инкубируют при 4 °C в течение 24 ч и затем оценивают результаты. Антиген (иммуноглобулин стандартной или исследуемой сыворотки) диффундирует в слое агара, содержащего антитела к человеческим иммуноглобулинам, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации (рис. 11, б). Чем выше концентрация иммуноглобулинов, тем больше диаметр кольца. Вначале оценивают размеры колец преципитации вокруг лунок, в которые были внесены стандартные сыворотки различного разведения с известной концентрацией иммуноглобулинов. По этим результатам строят кривую, отражающую зависимость между диаметром (площадью) кольца преципитации и концентрацией иммуноглобулина (рис. 11, в). Такую кривую строят для каждой пластины. Затем измеряют диаметр колец преципитации в испытуемом препарате и по стандартной калибровочной кривой определяют искомую концентрацию иммуноглобулинов.

Для количественного определения IgE, присутствующего в сыворотке  крови в низких концентрациях, применяют  более точные методы радиоиммунного или иммуноферментного анализа.

 

 

Реакция иммуноэлектрофореза

 

Используется в основном для  определения моноклональных иммуноглобулинов, например парапротеинов при миеломной болезни или макроглобулинемии Вальденстрема. Метод представляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки крови (или других биологических сред) и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов.

Для проведения реакции расплавленный  агар наносят на предметное стекло и делают в нем лунку (рис. 12, a). В лунку вносят исследуемую сыворотку и пластину помещают в электрическое поле, под действием которого происходит разделение различных белков сыворотки крови (рис. 12, б). По окончании электрофореза в агаровой пластине вырезают траншею, в которую вносят стандартную антисыворотку, содержащую антитела к определенным антигенам, например парапротеину (рис. 12, в). Если в исследуемой сыворотке имеются искомые антигены (парапротеин), уже через несколько суток в агаровом слое образуются полосы преципитации (рис. 12, г).

 

 

Рис. 12. Схема метода иммуноэлектрофореза:

а — внесение в лунку  исследуемой сыворотки с искомым  антигеном; б — электрофоретическое  разделение белков исследуемой сыворотки; в — внесение в траншею стандартной  антисыворотки с антителами к  искомому антигену; г — появление  дуг преципитации при наличии в исследуемой сыворотке искомого антигена

 

 

Метод иммуноэлектрофореза чаще используется для идентификации низких концентраций парапротеина при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема  и т.д.

 

 

Метод радиальной иммунодиффузии (по Манчини)

 

Количество и соотношение иммуноглобулинов отдельных классов в биологических  жидкостях отражают состояние В-системы. Иммунную сыворотку против антител  определенного класса (IgG, IgM, IgA) вносят в расплавленный агаровый гель. После  застывания агара антитела в нем равномерно распределены. Внесенный в лунку исследуемый материал (антиген) радиально диффундирует в толщу геля. Поскольку концентрация антител везде одинакова, то в результате реакции антиген-антитело в зоне эквивалентности образуются не полосы преципитации, а кольцо преципитации вокруг лунки с антигеном. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации антигена в исследуемой жидкости.

В предварительных опытах определяют оптимальное (рабочее разведение антисывороток  к иммуноглобулинам каждого класса. В каждом опыте устанавливают количество иммуноглобулинов стандартной сыворотке и по отношению к ней определяют количество иммуноглобулинов в исследуемом материале.

Используют 3%-ный агар Дифко на веронал-мединаловом буфере pH 7,3–7,4 (мединал — 35,4 г, веронал — 5,25 г, дистиллированная вода — до 1000 мл). В бактериологической пробирке смешивают по 5 мл расплавленного агара и антисыворотки. Берут два стекла размером 9×12 см, на одно из них помещаю П-образную рамку, сверху кладут второе стекло. Толщина рамки составляет 1 мм. В щель между стеклами заливают смесь агара и антисыворотки и оставляют в вертикальном положении для застывания агара на 15–20 мин. Затем удаляют одно из стекол и рамку.

В агаре пробойником вырезают лунки  диаметром 2 мм (5 рядов по 7 лунок в каждом). В лунки первого ряда вносят разведения стандартной сыворотки, в остальные — исследуемые пробы по 1 мкл. Пластинку выдерживают во влажной камере 24 ч (IgG, IgA) или 48 ч (IgM).

Строят калибровочную кривую. На оси абсцисс откладывают значения диаметров колец преципитации разведенной  стандартной сыворотки, на оси ординат  — значения концентраций иммуноглобулинов (% или мг/мл). Измеряют диаметр колец  преципитации в пробах и по калибровочной кривой устанавливают концентрацию соответствующего иммуноглобулина.

 

 

Реакция связывания комплемента

 

Реакция связывания комплемента (РСК) проводится с участием не только антигена и антитела, но и комплемента. Так  как она не сопровождается видимыми изменениями, для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика. В присутствии комплемента в гемолитической сыворотке происходит хорошо наблюдаемый лизис эритроцитов. Принцип метода состоит в том, что если в опыте образовался комплекс антиген-антитело и с ним связался комплемент (т.е. в растворе свободного комплемента не останется), то лизиса эритроцитов не произойдет и они осядут на дно пробирки. Если комплекс не формируется, то комплемент остается свободным и реагирует с гемолитической системой, вызывая лизис эритроцитов. Этот механизм лежит в основе реакции Вассермана (диагностика сифилиса). Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей антитела к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиза эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания антител с антигеном — комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, образуется иммунный комплекс, и происходит связывание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов.

В норме уровень комплемента  сыворотки крови составляет 20–40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических — ее снижение.

Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при следующих заболеваниях и синдромах:

1. Рецидивирующие бактериальные  пиогенные инфекции органов дыхания,  кожи и других органов: пневмонии,  бронхоэктазы, рецидивирующий синусит,  пиодермия, генерализованные бактериальные  инфекции, септицемия.

2. Рецидивирующие менингококковые  и гонококковые инфекции (менингококковый менингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.).

3. Аутоимунные,  аллергические заболевания и  болезни иммунных комплексов: системная  красная волчанка, дерматомиозит,  мембранопролиферативный гломерулонефрит, болезнь Шенлейн-Геноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический отек (особенно часто — ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др.

Реакция связывания комплемента используется для лабораторной диагностики риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, клещевой энцефалит и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + АТ. Комплемент адсорбируется на Fc-фрагменте иммуноглобулинов G и М.

Реакция протекает  в две фазы (рис. 13).

 

 

Рис. 13. Реакция связывания комплемента:

а — лизис сенсибилизированных  эритроцитов в присутствии комплемента; б — отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом АГ+АТ; в — лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса А

 

 

Первая фаза —  взаимодействие антигена и антитела. В качестве материала, содержащего  антитела, используется исследуемая  сыворотка, к которой добавляется  известный антиген. К этой системе  добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.

Вторая фаза —  выявление результатов реакции  при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроцитам барана). К смеси  антиген + антитело + комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37 °C в течение 30–60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке содержатся специфические антитела к диагностическому антигену. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител комплекс АГ + АТ не образуется и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Все компоненты РСК, за исключением исследуемой сыворотки, должны быть оттитрованы.

 

 

 

Тесты с ингибированием гемагглютинации эритроцитов

 

Данные методы не отличаются особой чувствительностью определений, но зато относительно просты в исполнении и нетрудозатратны. Для проведения такого исследования смешивают анализируемый объект с раствором антигена (подозреваемой патологии). Если в испытуемом образце имеются антитела к антигену возбудителя, происходит их комплексообразование, которое в дальнейшем предотвращает агглютинацию эритроцитов под влиянием молекул антигена.

Реакция выполняется  на планшетах с лунками с коническим дном, результат (наличие-отсутствие агглютинации) наблюдают непосредственно, т.е. невооруженным глазом. Натренированный человек способен различать даже степени протекания агглютинации. К сожалению, многие гликопротеины, являющиеся антигенами вообще, способны давать реакцию агглютинации эритроцитов, поэтому метод не отличается особой специфичностью.

 

Метод флуоресцирующих  антител для выявления патогенных бактерий и определения антител  к ним. Реакция иммунофлуоресценции

 

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флуоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционноспособные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы антиген - антитело становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом. С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов.

При некоторых заболеваниях внутренних органов, в развитии которых имеет  значение процесс иммунного воспаления или иммунной агрессии, в сыворотке  крови можно обнаружить аутоантитела к гладкой мускулатуре, эритроцитам, иммуноглобулинам, митохондриям, антиядерные (антинуклеарные) антитела, антитела к ДНК, противоопухолевые антитела и др. Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является метод иммунофлуоресценции, имеющий несколько модификаций и протекающий в два этапа. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап — в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ — простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется  как метод ранней экспресс-диагностики  гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

При прямой иммунофлуоресценции к исследуемому препарату (например срезам тканей), содержащему искомый антиген, добавляют антисыворотку с антителами к этому антигену. Предварительно антитела метят флуорохромом. В результате взаимодействия антигена и антитела образуется иммунный комплекс, который фиксируется только в тех участках ткани, где имеется данный антиген. Эти участки легко обнаруживаются при микроскопии в ультрафиолетовом свете по характерному свечению (флуоресценции).

В клинической практике по понятным причинам чаще используют метод непрямой иммунофлуоресценции. На срезы тканей различных органов животных, содержащих известные антигены, наносится исследуемая сыворотка (рис. 18, а). Если в ней содержатся антитела (иммуноглобулины) к данному тканевому антигену, происходит реакция связывания этих антител антигеном (рис. 18, б). Не связавшиеся белки тщательно отмывают и на срезы тканей наносят противочеловеческую IgG-антисыворотку, меченную флуорохромом (рис. 18, в). В результате антитела с флуорохромной меткой против иммуноглобулинов (например, против IgG), содержащиеся в антисыворотке (антитела к антителам-иммуноглобулинам класса G), связываются только с иммуноглобулинами (антителами), которые присутствовали в исследуемой сыворотке больного и остались фиксированными на соответствующих (известных) антигенах ткани (рис. 18, г). Люминесценция этих фиксированных антител хорошо выявляется при микроскопии ткани в ультрафиолетовом свете.

 Таким образом, на первом этапе непрямой иммунофлуоресценции происходит как бы «закрепление» антител больного в тех местах ткани, где локализованы соответствующие антигены (см. рис. 18, а, б), а на втором этапе — их обнаружение с помощью антител сыворотки к этим иммуноглобулинам, меченных флуорохромом (см. рис. 18, в, г).

 

 

 

Рис. 18. Схема метода непрямой иммунофлуоресценции:

а — нанесение исследуемой  сыворотки на срезы тканей с известным  антигеном; б — реакция связывания антител антигеном; в — внесение стандартной антисыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам человека, меченные флуорохромом; г — фиксация этих антител на антителах к искомому антигену

 

 

Метод иммунофлуоресценции используется для выявления аутоантител к  гладкой мускулатуре, митохондриям, антиядерных, антинуклеарных и других антител. Для их обнаружения в сыворотке крови больного обычно используют срезы желудка и почки крыс.

Иммунофлуоресцентное исследование — одна из наиболее простых процедур клинической диагностики (рис. 19). На пленку наносят исследуемый объект (сыворотка крови и т.п.). Образец может содержать, а может и не содержать антигены возбудителя подозреваемой патологии. Для проверки на ту же пленку наносят раствор антител к искомому антигену, конъюгированных (т.е. связанных ковалентно) с молекулами флуоресцирующего соединения, которое в данном случае выступает в роли маркера, удобного для обнаружения. Пленка выдерживается в растворе антител некоторое время, достаточное для связывания антител с антигенами (если таковые имелись в исследуемом образце), после чего избыток несвязавшихся антител смывается буфером, а пленку рассматривают под флуоресцентным микроскопом. Если в образце присутствовал антиген патологии, с его молекулами будут прочно связаны молекулы меченных флуоресцеином антител и под микроскопом можно наблюдать зеленое окрашивание.