Иммунологические методы диагностики

• распознавание антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой;

• обработка антигена макрофагом или другой антиген-презентирующей клеткой;

• презентация обработанного антигена в комплексе с белками МНС I и МНС II (Т-киллеры непосредственно  взаимодействуют с комплексом АГ* МНС I, а Т-эффекторы — посредством Т-хелперов);

• передача информации на Т-хелперы;

• передача информации на Т-эффекторы;

• пролиферация и дифференцировка  Т-эффекторной популяции под действием  интерлейкина.

Т-киллеры при встрече с чужеродной клеткой выделяют перфорин, разрушающий ее мембрану. Т-эффекторы оказывают опосредованное действие: выделяют факторы хемотаксиса, подавления миграции макрофагов и лейкоцитов, активации. Клетки в очаге пролиферации образуют инфильтрат, который окружается фибробластами, продуцируемым ими коллагеном, и становится гранулемой. Гранулема выполняет ограничивающую функцию — локализует процесс воспаления, препятствует его распространению; элиминирующая функция выражена слабо.

Т-клеточные ответы заканчиваются  формированием двух субпопуляций эффекторных Т-клеток:

1) цитотоксических Т-лимфоцитов (или  Т-киллеров);

2) эффекторных Т-лимфоцитов воспаления.

Оценка клеточного звена иммунной системы включает определение количества (по CD маркерам) различных субпопуляций Т-клеток (CD3,CD4 и др.) с помощью моноклональных антител и изучение их функциональных свойств (пролиферация в ответ на митогены, аллоантигены и др.). Оценка проводится как in vivo, так и in vitro.

 

 

 

Определение количества субпопуляций Т-лимфоцитов

 

Принцип метода: моноклональные антитела (мАТ) к поверхностным дифференцировочным антигенам лимфоцитов периферической крови используют для определения их фенотипа и количественного учета. Количество лимфоцитов определенного фенотипа существенно изменяется при вирусных заболеваниях и аутоиммунных патологиях, стрессе. Определение фенотипа лимфоцитов рекомендуется проводить при использования иммуномодуляторов, при наличии клинических признаков иммунологической недостаточности. Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов осуществляется на проточных цитометрах после их специфического связывания с мАТ и окрашивания антиглобулиновыми антителами, меченными флуорохромом или на люминесцентном микроскопе. В настоящее время существует большое количество типов антител к дифференцировочным антигенам лимфоцитов животных. Классификация мАТ базируется на группах мАТ, реагирующих с одними и теми же дифференцировочными антигенами на лимфоцитах человека (CD — cluster of differentiation; CD-номенклатура).

 

Циркулирующие иммунные комплексы

 

В последние годы большое диагностическое  значение придают определению в  сыворотке крови циркулирующих  иммунных комплексов (ЦИК). Они представляют собой растворимые комплексы  антиген-антитело, которые в норме  фагоцитируются макрофагами и разрушаются. Для определения ЦИК используют метод осаждения (преципитации) ЦИК раствором полиэтиленгликоля. После инкубации и центрифугирования выпавшие в осадок ЦИК растворяют раствором едкого натра и определяют их содержание в растворе на спектрофотометре, выражая количество иммунных комплексов в единицах оптической плотности. Определение ЦИК в сыворотке крови возможно также с помощью метода иммунофлуоресценции. Увеличение концентрации ЦИК может иметь два важных в практическом отношении следствия.

Во-первых, ЦИК могут приводить к повреждению мембран и способствовать развитию иммунопатологического процесса в органах. Особенно часто это наблюдается при снижении функциональной активности тканевых макрофагов.

Во-вторых, ЦИК обладают способностью активировать систему комплемента, хемотаксическим действием по отношению к лимфоцитам и нейтрофилам, активируют систему свертывания крови, кининовую систему, выделение гранулоцитами и макрофагами биологически активных веществ и т.д. Эти эффекты ЦИК сопровождаются развитием воспаления тканей. Повышение концентрации ЦИК обнаруживают при многих заболеваниях, в основе которых лежат нарушения клеточного иммунитета, в первую очередь при различных аутоиммунных заболеваниях.

 

 

Определения фенотипа и количества лимфоцитов с  помощью моноклональных антител на лазерном проточном цитометре методом непрямой иммунофлуоресценции

 

Немеченые мышиные  моноклональные антитела (мАТ) к соответствующим поверхностным рецепторам разных популяций лимфоцитов крови человека (животных) после их прикрепления визуализируются добавлением антимышиных иммуноглобулинов, меченных флуоресцентными красителями (например ФИТЦ или фикоэритрином).

Необходимое оборудование:

• мАТ нужной специфичности.

• Лейкоцитарная клеточная взвесь или мононуклеарные клетки крови, выделенные из 3 мл крови.

• Среда 199.

• 1%-ный параформальдегид.

• Фиколл-верографин.

• 70%-ный глицерин.

• Проточный цитофлуориметр.

• Центрифуга на 3000 об/мин.

• Термостат 37 °C.

• Холодильник бытовой (+4 °C).

• Полная рабочая среда (ПРС).

• Лизирующий раствор.

Постановка метода:

1. Производится забор крови из  вены в объеме 3 мл с гепарином  (из расчета 15–20 единиц на 1 мл крови).

2. Наслаивают на 0,5 мл раствора фиколл-верографина (плотностью 1,077 г/см³) и центрифугируют при 400g 25 мин.

3. Пастеровской пипеткой отбирают лейкоцитарное кольцо и дважды отмывают центрифугированием (200g, 10 мин) в среде 199.

4. Осадок ресуспендируют в среде  199 с 2%-ной эмбриональной телячьей  сывороткой в объеме 1 мл.

5. С помощью камеры Горяева  определяют число ядросодержащих  клеток и доводят их концентрацию до 2·10⁶ клеток/мл средой 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой.

6. К осадку клеток добавляют 0,5 мл ПРС, клеточную взвесь разливают по 50 мкл в лунки 96-луночных круглодонных планшетов.

7. В каждую лунку вносят по 50 мкл предварительно разведенных мАТ: первая лунка — контроль (добавляют ПРС), 2-я, 3-я, 4-я, 5-я лунки — мАТ CD3, CD4, CD8, CD21 соответственно.

8. Планшет ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).

9. Клетки дважды отмывают от мАТ путем добавления в каждую лунку по 200 мкл ПРС и центрифугирования планшетов в течение 5 мин при 1000 об/мин.

10. В случае если мАТ не соединены с флуорохромом, проводят процедуру докрашивания, добавляя в каждую лунку по 50 мкл антимышиных иммуноглобулинов, меченых ФИТЦ в соответствующем инструкции разведении.

11. Планшеты ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).

12. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл ПРС и затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин (300g). Надосадочную жидкость из планшета стряхивают резким движением.

13. Лизируют оставшиеся в пробе эритроциты: к осадку добавляют по 200 мкл лизирующего раствора.

14. Встряхивают на шейкере 1 мин, сразу центрифугируют 5 мин при 300g, надосадочную жидкость выливают резким движением.

15. Быстро добавляют ПРС до полного объема лунки, центрифугируют при тех же условиях и сливают надосадочную жидкость.

16. Для фиксации к осадку добавляют по 100 мкл 2%-ного параформальдегида и ставят на 30 мин в холодильник (4 °C).

17. Добавляют ПРС до полного объема лунки.

Для длительного хранения препаратов слегка увлажняют прокладку из фильтровальной бумаги, закрывают планшет этой бумагой и сверху накрывают крышкой. Планшет помещают в холодильник и затем просчитывают образцы на цитометре.

 

 

 

Определение фенотипа и количества лимфоцитов с помощью  моноклональных антител на люминесцентном микроскопе

 

Приготовление образцов крови для  просмотра под люминесцентным микроскопом  осуществляется так же, как и для  анализа на проточном цитометре (см. выше).

После фиксации взвесь клеток помещают на очищенное предметное стекло на 20 мин для их осаждения, затем стекло переносят под струю холодного воздуха (под вентилятор) для уменьшения объема жидкости. Добавляют каплю 50%-ного глицерина на фосфатном буфере, сверху аккуратно накрывают покровным стеклом. Избыток глицерина удаляют фильтровальной бумагой. Под микроскопом определяют процент светящихся клеток при объективе ×90. В качестве иммерсионного средства можно использовать 50%-ный или 70%-ный глицерин, приготовленный на фосфатном буфере. В одном образце просчитывается 200–500 клеток.

 

 

 

Определение количества лимфоцитов в лимфотоксическом тесте  с помощью моноклональных антител

 

Принцип метода. Для определения субпопуляций Т-лимфоцитов можно использовать методы проточной цитометрии, непрямой иммунофлуоресценции и лимфотоксический тест (ЦТТ). Для выполнения этих методов необходимы мАТ к дифференцировочным антигенам (АГ) Т-лимфоцитов. В случае отсутствия проточного цитометра применение ЦТТ имеет ряд преимуществ перед иммунофлуоресценцией: этот метод более прост. Он основан на способности мышиных мАТ класса IgM и IgG и комплемента оказывать цитотоксическое воздействие на соответствующую субпопуляцию лимфоцитов, что выявляется с помощью красителя. Для идентификации лимфоцитов различных популяций используют мАТ-фиксирующий комплемент. После инкубации лимфоцитов с мАТ необходима дополнительная инкубация клеток с антимышиными кроличьими сыворотками.

Постановка метода:

1. Кровь в объеме 0,5 мл разводят  в отношении 1:2 средой 199.

2. Наслаивают на 0,5 мл раствора  фиколл-верографина (плотностью 1,077 г/см³) и центрифугируют при 400g 25 мин.

3. Пастеровской пипеткой отбирают  лейкоцитарное кольцо и дважды  отмывают центрифугированием (200g, 10 мин) в среде 199.

4. Осадок ресуспендируют в среде  199 с 2%-ной эмбриональной телячьей  сывороткой в объеме 1 мл.

5. С помощью камеры Горяева  определяют число ядросодержащих  клеток и доводят их концентрацию  до 2·10⁶ клеток/мл средой 199 с 2%-ной эмбриональной телячьей сывороткой.

6. В лунку 96-луночного планшета  вносят 20 мкл суспензии лимфоцитов (объем суспензии при указанной концентрации может колебаться от 10 до 40 мкл) и 5 мкл мАТ в рабочем разведении

7. Инкубируют 40 мин при комнатной  температуре.

8. Центрифугируют 5 мин при 300g для  удаления избытка мАТ и надосадок  сливают.

9. В качестве источника комплемента  (подбор комплемента см. ниже) к  осадку добавляют 25 мкл свежей  сыворотки кролика в разведении 1:2, осадок взбалтывают и инкубируют 90 мин при комнатной температуре.

10. В лунку вносят 10 мкл 2%-ного  раствора эозина на изотоническом растворе хлорида натрия.

11. Через 5 мин в лунки добавляют  10 мкл 1–2%-ного формальдегида  с pH 7,2–7,4, что дает возможность  сохранять препарат в течение  нескольких дней. ЦТТ можно остановить  переносом планшетов с реакцией  на лед, но в этом случае результаты реакции учитывают в течение 1–2 ч.

Результаты ЦТТ учитывают в  препарате «раздавленная капля» (объектив ×20). Целесообразно просматривать  препараты в микроскопе с фазовоконтрастным  устройством для более точной идентификации лимфоцитов и моноцитов и возможной примеси нейтрофилов. Считают число «убитых» лимфоцитов на 200 лимфоцитов. Убитые клетки окрашены, существенно увеличены, становятся как бы плоскими, распластанными. Средние арифметические значения содержания (± стандартные отклонения) Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров/киллеров у здоровых добровольцев составляют 74,9 ± 4,8; 42,9 ± 7,3 и 24,8 ± 6,2 соответственно, что совпадает с данными, полученными с помощью метода цитофлуориметрии.

Подбор комплемента — важнейший  этап в ЦТТ. В качестве последнего используют свежую сыворотку кроликов массой 1,5–2,0 кг. Комплемент получают смешиванием сывороток от нескольких (6 и более) животных, предварительно проверенных на отсутствие токсичности и достаточную активность в ЦТТ. Сыворотку кроликов получают на холоде с последующим замораживанием при –70 °C. Комплемент при этом может храниться в течение 1–1,5 мес. При замораживании в жидком азоте срок хранения неограничен. Размороженные образцы комплемента должны быть использованы в течение 4 ч. Повторное замораживание не допускается!

 

 

 

Метод оценки функциональной активности лимфоцитов in vitro ─ реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

 

Принцип метода. Существуют вещества растительного и бактериального происхождения, которые оказывают на лимфоциты млекопитающих митогенное действие. Для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов используют фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кон A) — лектины растительного происхождения, а для оценки функционального состояния В-клеток (в присутствии Т-лимфоцитов) — митоген лаконоса (МЛ). Мононуклеары периферической крови инкубируют в присутствии вышеуказанных митогенов в течение 72 ч. Результаты реакции оценивают по включению Н³-меченого тимидина.

Постановка метода реакции бласттрансформации с клетками селезенки мышей не имеет принципиальных отличий при использовании клеток крови других животных. Селезенки мышей забирают в стерильных условиях и готовят клеточную суспензию: селезенки помещают во флакончики со средой, расстригают ножницами, многократно пропускают через шприц с иглами уменьшающегося диаметра, фильтруют через металлическую сеточку и 3 раза отмывают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды. Осадок клеток селезенки ресуспендируют в полной среде RPMI-164, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки телят, 10 мМ Hepes, 4·10^–5 М 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, и подсчитывают их общее количество. Полученную клеточную суспензию доводят до концентрации 0,7·10⁶ клеток/мл полной среды и помещают в 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования по 100·10³ клеток/лунку в объеме 150 мкл/лунку. Добавляют оптимальные дозы митогенов LPS E. сoli 055:B5, Con A, PWM, определенные в предварительных опытах: 30 мкг/мл, 2 мкг/мл и 1мкг/мл соответственно — в объеме 10 мкл. Для оценки спонтанной пролиферации в лунки добавляют 10 мкл среды RPMI-1640. Все пробы проводятся в триплетах. Инкубацию клеточной культуры проводят при +37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО₂, в течение 72 ч.

Пролиферативную активность клеток оценивают по включению Н³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносят за 16 ч до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н³-тимидина сначала растворяют в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляют в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирают на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата Harvester (TITERTEK). Фильтры помещают во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывают в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенилоксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике Delta. Результаты оценивают в имп/мин. на 100·10³ клеток, подсчитывают средние значения по триплету. Оценка результатов проводится как в абсолютных значениях, так и в индексах стимуляции (ИС):