Иммунологические методы диагностики

• антитоксическое действие;

• антимутагенный эффект;

• радиопротективный эффект;

• подавление или усиление продукции  антител;

• стимуляция макрофагов, усиление фагоцитоза;

• усиление цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени;

• активация естественных киллерных  клеток.

Существует три типа природного интерферона: альфа (ИНФ-α), бета (ИНФ-β), гамма (ИНФ-γ). Это интерфероны 1-го поколения. Диагностическую ценность имеет  выявление уровня интерферона в сыворотки крови и определение способности лейкоцитов периферической крови продуцировать различные типы интерферонов в ответ на активирующий сигнал (вирусные частицы или иммуномодуляторы). Такое исследование и получило название «Интерфероновый статус».

Целью определения интерферонового  статуса является:

1. Исследовать способность иммунной  системы к развитию адекватных  иммунологических реакций в ответ  на этиологический фактор.

2. Выявить уровень продукции  интерферона в настоящий момент (в норме или на фоне заболевания).

3. Подобрать иммуномодулирующий  препарат, на который развивается  максимальный ответ иммунокомпетентных  клеток для применения в терапевтических  целях.

Исследование интерферонового  статуса включает определение уровня сывороточного интерферона (ИФН), спонтанной продукции ИФН, способности лейкоцитов к стимулированной продукции ИФН-α (под воздействием вируса болезни Ньюкасла), а также способности продуцировать ИФН-γ под воздействием фитогемагглютинина.

Показатель «Циркулирующий интерферон», варьирующий в норме от 2 до 8 ед/мл, характеризует суммарное «фоновое» количество всех типов интерферонов, циркулирующих в крови, смесь интерферонов различных типов. У здоровых взрослых и детей старшего возраста в кровотоке определяется незначительная часть интерферона в результате его разведения и быстрого выведения. Процессы продукции и элиминации интерферона находятся в равновесии, и уровень сывороточного интерферона в кровотоке не выходит за пределы нормы. Уровень (циркулирующего) сывороточного интерферона служит объективным суммарным показателем количества данного белка in situ, повышенный уровень — показатель остроты процесса.

Анализ информативен, когда необходимо оценить общее количество интерферона: подозрение на генерализованный герпес, гепатит, рассеянный склероз (общее снижение), бронхиальная астма, крапивница (корреляция со степенью тяжести) и др.

Определение уровня продукции  α- и γ- интерферонов дает важную информацию о потенциальной активности системы интерферона. Взрослые доноры способны к значительной их продукции (до 640 ед/мл для γ-интерферона).

Все интерфероны обладают противовирусным, иммуномодулирующим, противоопухолевым  и антипролиферативным эффектами.

ИНФ-α:

• обладает выраженным противовирусным  и противоопухолевым действием, в этом есть сходство с ИНФ-β;

• в меньшей степени проявляет  иммуномодулирующие свойства.

Основными клетками продуцентами для  ИНФ-α являются В-лимфоциты, макрофаги (для ИНФ-β — клетки эпителия, фибробласты).

Титры ИФН-α в пробах цельной крови — показатель функциональной активности В-лимфоцитов и состояния противовирусной защиты организма;

Уровень ИНФ-α в норме варьирует от 128 до 640 ед/мл.

ИНФ-γ:

• обладает выраженным иммуномодулирующим действием;

• вместе с интерлейкином-2 (ИЛ-2) и  фактором некроза опухолей (ФНО α) относится к основным провоспалительным цитокинам;

• является индуктором клеточного звена  иммунитета.

Противовирусные и противоопухолевые  свойства слабее, чем у ИНФ-α и  ИНФ-β. Основными клетками-продуцентами являются Т-лимфоциты, натуральные или естественные киллеры (NK-клетки).

Титры ИФН-γ — показатель функциональной активности Т-лимфоцитов и способности  к активации иммунной системы (в  частности, при вирусных инфекциях).

Уровень ИНФ-γ в норме варьирует  от 32 до 256 ед/мл.

Нормализация показателей уровня интерферонов является критерием эффективности терапии, и, как правило, коррелирует с положительной динамикой заболевания.

Показатели ИФН-статуса в целом  позволяют судить об иммунореактивности организма:

1. У здоровых лиц наблюдается  определенное содержание сывороточного интерферона и значительный «запас» продукции α- и γ-интерферонов.

2. Стрессы и острые вирусные  инфекции, аллергические состояния  характеризуются повышением уровня  сывороточного интерферона и  снижением уровня индуцируемой  продукции α- и γ-интерферонов.

3. Хронические вирусные инфекции (герпес, гепатит, рассеянный склероз)  сопровождаются глубоким подавлением  всех показателей интерферонового  статуса.

4. Аутоиммунные заболевания (системная  красная волчанка, ревматоидный  артрит) характеризуются подавлением индуцируемой продукции α-интерферона, наличием спонтанно вырабатываемого ИФН.

5. Острый лимфолейкоз, злокачественные  образования, проказа сопровождаются  подавлением индуцируемой продукции  γ-интерферона.

6. При бронхиальной астме, крапивнице уровень сывороточного интерферона коррелирует с тяжестью заболевания.

 

 

 

Изучение неспецифической  резистентности организма

 

Защиту макроорганизма от возбудителей инфекционных болезней обеспечивает не только иммунная система, но и механизмы  неспецифического порядка: непроницаемость слизистых и кожных покровов, фагоцитоз, бактерицидное действие лизоцима, а также гуморальные факторы: комплемент, пропердин и др.

 

 

Количественное  определение лизоцима в сыворотке крови

 

Лизоцим — гидролитический фермент, расщепляющий высокомолекулярные полисахариды бактерий (пептидогликан), находится в тканях, секретах, экскретах (за исключением пота и мочи), действует бактерицидно на многие бактерии. Присутствие и активность лизоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lysodeicticus.

Готовят 1%-ный агаровый гель (Дифко) на 0,15M фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар температурой 60–70 °C вносят ацетоновый порошок биомассы М. lysodeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты перемешивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В застывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.

Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного  белка. Для этого лизоцим разводят в 015M ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5; 1; 3; 5, 10; 20; 40 и 70 мг/мл. По 0,05 мл каждого разведения лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 °C и измеряют диаметр зоны лизиса М. lysodeicticus вокруг лунок.

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса.

Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1:5, вносят по 0,03 мл в  лунки и далее поступают как  при определении активности стандартного лизоцима. Измерив диаметр зоны лизиса, по калибровочной кривой вычисляют содержание лизоцима в исследуемой пробе.

 

 

Количественное  определение комплемента в сыворотке  крови

 

Комплемент (С) представляет собой сложную систему главным образом неактивных белков крови. Процесс их активации (по классическому пути) запускается образованием комплекса антиген-антитело (АГ-AT) и происходит в виде цепной реакции: комплекс АГ-АТ + С1 + С4 + С2 + С3 + С5 + С6 + С7 + С8 + С9. В процессе активации образуется литический комплекс, который делает мембрану клетки проницаемой, внутрь клетки осмотически поступает вода, в результате клетка набухает и лопается. Такое разрушение клеток (антигенов) под влиянием антител и комплемента получило название иммунного лизиса. Наиболее эффективно комплемент действует на бактериальные клетки в сочетании с лизоцимом. Кроме того, бактериальные клетки (антигены) после взаимодействия с антителами и комплементом легче поглощаются фагоцитами.

Количество комплемента в крови (сыворотке крови) определяют в реакции иммунного лизиса с использованием эритроцитов барана и гемолизина в качестве антител к эритроцитам барана. Эритроциты барана, обработанные гомологичными антителами и чувствительные в таком состоянии к литическому действию комплемента, называют гемолитической системой. Количество комплемента измеряют в гемолитических единицах (СН₅₀). За единицу комплемента принимают такое его количество в объеме 0,5 мл, которое за 30 мин при 37 °C обусловливает лизис 50 % эритроцитов в 0,5 мл гемолитической системы (5%-ная суспензия эритроцитов барана в веронал-мединаловом буферном растворе с pH 7,3–7,4 + гемолизин в тройном титре).

Исследуемую сыворотку в возрастающих дозах разливают по пробиркам (например, 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,10 мл), добавляют ФСБР до 0,5 мл, вносят во все пробирки по 0,5 мл стандартизированной гемсистемы. Одновременно ставят контроль на резистентность эритроцитов (0,5 мл ФСБР + 0,5 мл гемсистемы). Пробирки встряхивают и выдерживают при 37 °C 30 мин, охлаждают при 2–4 °C 10 мин, центрифугируют при 3000 об/мин 15–20 мин, насадочную жидкость колориметрируют и по коэффициенту экстинкции определяют процент гемолиза при помощи заранее построенной калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят следующим образом: к 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов добавляют 3 мл дистиллированной воды, эритроциты при этом полностью лизируются (100%-ный гемолиз). Из полученного лизата путем добавления буферного раствора готовят пробы с 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90%-ным гемолизом. На фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность каждой пробы (кювета шириной 1 мм, синий светофильтр), затем на оси абсцисс откладывают процент гемолиза, а на оси ординат — коэффициент экстинкции. СН₅₀ вычисляют по дозе сыворотки, дающей гемолиз, наиболее близкий к 50 %. Для этого используют специальную формулу (Крога) или, что проще, коэффициенты, рассчитанные по этой формуле.

Например, если исследуемая сыворотка  в разведении 1:25 дает 30%-ный лизис, то СН₅₀ в 1 мл составит 25 · 0,844 = 21,1 ед.

 

 

Фагоцитоз бактерий

 

К фагоцитирующим клеткам относят  полиморфноядерные лейкоциты крови. Поглощение микробной клетки фагоцитом  может не сопровождаться гибелью  микроорганизма (незавершенный фагоцитоз) или приводить к внутриклеточному перевариванию захваченных бактерий (завершенный фагоцитоз).

Белой мыши внутрибрюшинно сначала  вводят 2 мл стерильного МПБ, через 2–3 ч — 0,5 мл культуры эшерихий. Спустя 20–40 мин шприцем из брюшной полости  отбирают экссудат, делают мазки на предметном стекле, фиксируют спирт-эфиром, окрашивают метиленовым синим (экспозиция 2–3 мин). При микроскопировании можно наблюдать различные стадии фагоцитоза: поглощение, деструкцию (переваривание) клеток (рис. 6 цветной вкладки).

Методы оценки активности фагоцитирующих клеток. Для оценки активности фагоцитов используют следующие показатели: 1) фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток от общего числа учтенных нейтрофильных лейкоцитов;

Фагоцитарное число — среднее  число микробных клеток, поглощенных  одним лейкоцитом (характеризует интенсивность фагоцитоза).

Определение фагоцитарного показателя: в чистую стерильную центрифужную пробирку вносят 0,2 мл 2%-ного раствора цитрата  натрия, 0,1мл крови, взятой у морской  свинки или кролика, и 0,05 мл суспензии  убитых нагреванием бактерий S. epidermidis, E. coli или др. (концентрация 0,5·10⁹ клеток по оптическому стандарту мутности). Компоненты перемешивают и выдерживают при 37–38 °C 30 мин, затем центрифугируют при 2500–3000 об/мин 15–20 мин до образования прозрачного слоя плазмы, слоя эритроцитов и тонкого сероватого среднего слоя лейкоцитов. Осторожно отсасывают плазму, пипеткой берут средний слой, делают три—пять мазков и окрашивают по методу Романовского – Гимзы. Препарат микроскопируют, подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и определяют среди них число (%) фагоцитирующих.

Определение фагоцитарного  числа. В мазках, которые были приготовлены для определения фагоцитарного показателя, подсчитывают 100 нейтрофильных лейкоцитов и суммарное количество захваченных ими бактериальных клеток, затем определяют фагоцитарное число. Например, 100 лейкоцитов поглотили 500 бактериальных клеток, следовательно, фагоцитарное число равно 500 : 100 = 5,0.

Определение опсоно-фагоцитарного  индекса. Интенсивность фагоцитоза повышается благодаря антителам — опсонинам, взаимодействующим с микробными клетками. Чтобы определить опсоно-фагоцитарный индекс, сравнивают активность фагоцитов в нормальной и исследуемой (иммунной) сыворотках.

Пастеровской пипеткой набирают на высоту капилляра около 2 см сначала суспензию бактериальных клеток (0,5·10⁹/мл), затем лейкоцитов и, наконец, исследуемую сыворотку. На предметном стекле компоненты перемешивают при помощи пипетки, затем вновь набирают в капилляр, конец которого запаивают. Капилляр помещают в термостат при 37 °C на 30 мин. После инкубирования смесь выливают на предметное стекло, готовят мазок и окрашивают его метиленовым синим (1 мл насыщенного спиртового раствора на 30 мл дистиллированной воды).

Аналогичным образом готовят препарат с нормальной (контрольной) сывороткой. Оба препарата микроскопируют, просматривают 100 нейтрофильных лейкоцитов, определяют количество фагоцитированных бактерий, рассчитывают фагоцитарное число в каждой сыворотке и затем опсоно-фагоцитарный индекс исследуемой сыворотки. Например, в 100 лейкоцитах нормальной сыворотки фагоцитировано 200 бактерий, следовательно, фагоцитарное число 200 : 100 = 2. В 100 лейкоцитах исследуемой иммунной сыворотки захвачено 500 бактерий, и фагоцитарное число 500 : 100 = 5.

Опсоно-фагоцитарный индекс показывает, во сколько раз процесс фагоцитоза в иммунной сыворотке интенсивнее, чем в нормальной. Его вычисляют делением фагоцитарного числа иммунной сыворотки на фагоцитарное число нормальной сыворотки. В приведенном примере опсоно-фагоцитарный индекс составит 5,0 : 2,0 = 2,5.

 

Проточная цитофлуориметрия

 

Метод проточной цитофлуориметрии (ПЦ) основан на измерении определенных свойств клеток, вводимых в поток  жидкости. Проточный цитометр состоит  из трех основных блоков: оптического, где производится измерение, блока обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются из оптических в электрические, блока сбора и обработки данных (компьютер).

Оптический блок предназначен для  измерения рассеивания света  и флуоресценции. Клетки вводят в  поток жидкости, ширина которого составляет 50–100 мкм. На струе сфокусирован лазер. В момент прохождения клеток через луч лазера они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Переднее рассеивание света в направлении лазерного пучка обусловлено многими параметрами исследуемого объекта, в том числе размером клетки. На основе данного параметра можно отличать жизнеспособные лимфоциты от мертвых и эритроцитов. Перпендикулярное или боковое рассеяние света под углом 90° по отношению к лазерному лучу позволяет различать популяции клеток, таких как лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Флуоресцентные сигналы измеряют с помощью разделяющих, дихроических и обычных зеркал. В большинстве проточных цитометров удается одновременно измерять несколько флуоресцентных сигналов, что дает возможность определять фенотип клетки, степень ее активации, стадию дифференцировки и другие дополнительные характеристики.