Иммунологические методы диагностики

Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) представляет собой прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым и основными показаниями к его применению являются острая, хроническая формы заболевания, необходимость установления этиологии инфекционного процесса. Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител могут составлять 60 % и 80 % соответственно. Методика требует ее исполнения опытным лабораторным работником, высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко бывает доступной, в частности, оценка эффективности лечения. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец — возможны ложноотрицательные результаты.

 

 

Рис. 19. Иммунофлуоресцентное исследование

 

 

Диагностическое значение результатов, полученных методом прямой иммунофлуоресценции (ПИФ). Известно, что при использовании  метода ПИФ относительно часто получают также ложноположительные результаты, поэтому его предлагается использовать только как ориентировочный (скрининговый) метод выявления патогена. Получение ложноположительных результатов может быть обусловлено, прежде всего, низким качеством диагностических наборов и субъективным характером трактовки получаемых данных. Несмотря на появившееся скептическое отношение к использованию метода иммунофлуоресценции, он остается весьма распространенным.

 

 

 

Иммуноферментный  анализ

 

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. — enzyme-linked immunoSorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов.

Иммуноферментный метод также  основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей  обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу. В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции — с выявляемыми антителами и в соединении этого комплекса антиген-антитело с иммуноглобулинами, содержащим ферментную метку.

Иммуноглобулины, применяемые в  таких тест-системах, так называемый конъюгат, может быть получен на основе антивидовых антител (например кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного класса (M, G, А).

В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет  выявлять в исследуемом образце  или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определенного  класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M).

Существует несколько методов  постановки реакции, однако в настоящее  время используются в основном следующая  схема (рис. 20).

 

 

Рис. 20. Схема проведения иммуноферментного анализа:

а — антитела против антигена сорбированы на стенках пробирки; б — добавление исследуемой сыворотки к искомым антигенам, которые взаимодействуют с антителами и фиксируются на стенках пробирки; в — введение антител к данному антигену, меченных ферментом (пероксидазой), которые также фиксируются на стенках пробирки; г — добавление перекиси водорода и хромогена, который под действием кислорода, выделяющегося при разложении Н₂О₂ пероксидазой, изменяет свой цвет на желтый

 

 

Вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемую сыворотку (или другой биологический субстрат). Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н₂О₂) и хромогены. Фиксированный к стенке пробирки фермент (пероксидаза) разлагает Н₂О₂ с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают спектрофотометрически или визуально.

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов  иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе (рис. 21). В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем — смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.

 

 

Рис. 21. Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердофазного  ИФА

 

 

По такому принципу построена основная масса тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Однако следует отметить, что  иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счет антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приеме лекарственных препаратов; у новорожденных ложноположительные реакции могут возникать за счет образования в организме ребенка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.

В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител  подразделяются на:

• лизатные — в которых используется нативный антиген (лизированный или  обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

• рекомбинантные — в которых  используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;

• пептидные — использующие химически  синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего  антигенного многообразия возбудителя  выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (т.е. в организме  инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (т.е. характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрестных реакций с антителами другой природы).

Кроме того, большое значение имеет  качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удается достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

Таким образом, за счет несомненных  преимуществ иммуноферментного  анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации  учета результатов, возможности  исследования иммуноглобулинов различных  классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) — в настоящее время этот метод является одним из основных в  лабораторной диагностике.

Методика. Используются специальные 96-луночные (8 рядов по 12 лунок) планшеты из полистирола, с круглыми плоскодонными лунками вместимостью около 300 мкл.

Перед анализом планшету сенсибилизируют, нанося раствор антигена. Обычно это  не целая структура возбудителя, а часть (наиболее характерная) белков его оболочки. Очень часто антигены для ИФА получают генно-инженерными технологиями, выращивая на трансгенных E. сoli.

Растворимые антигены закрепляются на поверхности планшеты рядом специфических  взаимодействий непосредственно из раствора. Для снижения помех участки  незанятой антигеном поверхности  «укрывают» нанесением раствора бычьего сывороточного альбумина. Несвязанный материал удаляют и планшету сушат. Сенсибилизированные планшеты можно хранить при –18 °C не более 2 недель.

При выполнении анализа лунки заполняют  исследуемым материалом (сыворотка  крови), нанося его в разные лунки с дробным разбавлением (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и т.д.), после чего выдерживают около 30 мин для связывания. Если в образцах имеются антитела, комплементарные нанесенному антигену, они образуют с ним прочные комплексы. Содержимое из лунок удаляют трехкратной промывкой буфером и несвязавшийся материал удаляется при промывке.

 Далее лунки заполняются раствором конъюгата, представляющего собой связанные глутаровым альдегидом молекулы белка-фермента (чаще всего — пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) и молекулы антител против антител к возбудителю, полученные из сыворотки кролика (или другого организма) при введении в его кровь антител человека к искомому возбудителю. Дают время на прохождение реакции комплементарного связывания, после чего избыток раствора конъюгата удаляется и лунки промываются буфером. Молекулы конъюгата осаждаются на молекулах осадившихся на антигене антител из испытуемого образца. В довершение всего лунки заполняют раствором субстрата, превращение которого в окрашенный продукт осуществляется конъюгированным ферментом. Такое ферментативное превращение осуществляется примерно 60 мин, после чего реакция останавливается добавлением кислоты. Количество превращенного субстрата пропорционально концентрации конъюгата и, следовательно, концентрации антител против возбудителя в исследуемом образце. По плотности окраски в УФ-свете можно судить о концентрации антител в исследуемой сыворотке. В «холостых» контрольных лунках параллельно проводят реакцию для установления порога «шумов». Имеются также лунки, заполненные антителами из контрольного раствора для проверки специфичности реакции.

В качестве субстратов для конъюгатов с пероксидазой хрена применяется  о-фенилендиамин в смеси с перекисью  водорода, дающие после остановки  реакции оранжево-коричневые растворы, измеряемые при 492 нм. Субстратом для щелочной фосфатазы является п-нитрофенилфосфат, превращающийся в п-нитрофенол, индицируемый при 405 нм.

ИФА повышает чувствительность анализа  благодаря «усилению сигнала» на конъюгированном ферменте. На каждую молекулу исследуемого в сыворотке антитела «садится» по одной молекуле фермента, которая способна катализировать превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Однако и чувствительность ИФА имеет ограничения. В первые дни после заболевания число антител в крови может оказаться настолько малым, что ИФА часто дает так называемую «серонегативную реакцию».

Современные методы иммунологии позволяют  обнаруживать в биологических средах ничтожно малые количества некоторых  органических и неорганических веществ (гормонов, ферментов, витаминов, биологически активных веществ, антител к определенным тканям и органам, лекарств и т.п.), которые не выявляются классическими биохимическими и иммунологическими методами. Наиболее чувствительными являются радиоиммунный и иммуноферментный методы исследования.

 

 

 

Радиоиммунологический анализ (РИА)

 

Радиоиммунный метод является наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченого радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде.

С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие  антигена, добавляют известное количество такого же меченого антигена и стандартное количество антисыворотки с соответствующими антителами (рис. 22, а). Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70–80 % меченого антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата (рис. 22, б). Если же в биологической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченым антигеном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем (рис. 22, в). На этом принципе основано количественное определение антигенов или антител.

 

 

Рис. 22. Принцип радиоиммунного метода:

а — добавление в исследуемую  жидкость стандартной антисыворотки  с антителами и антигена, меченного  радиоактивным изотопом; б — образование  радиоактивных преципитатов при  отсутствии в исследуемой жидкости искомого антигена; в — при наличии искомого антигена

 

 

РИА — один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его  применяют для выявления антигена вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой  сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1–2 сут. при температуре 40 °C, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом ¹²⁵J) и продолжают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 23). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченым антигеном и поэтому он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител.