Иммунологические методы диагностики

 

ИС = имп/мин митогениндуцированной  пролиферации .

  имп/мин спонтанной пролиферации

 

Результаты экспериментов представляются в виде среднего счета (имп/мин) из трех идентичных культур.

Показания к применению. Проведение РБТЛ целесообразно в случае: первичных иммунодефицитов, связанных с нарушениями клеточного иммунитета; вторичных иммунодефицитов, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания); физиологических иммунодефицитов, например, при старении, когда ослабление иммунитета затрагивает реакции, обусловленные Т-клетками, что служит одной из причин повышения частоты опухолей в старости; аутоиммунных заболеваний.

Необходимое оборудование и реактивы:

1. Ламинарный бокс (рис. 17).

2. 96-луночные круглодонные планшеты.

3. Инкубатор на 37 °C с возможностью поддерживать 5%-ную атмосферу СО₂ (Flow).

4. Автоматические пипетки с переменным  объемом («Ленпипет»).

5. Фиколл-пак (Sigma).

6. Среда 199 (Sigma).

7. Среда для культивирования  клеток: RPMI-1640 (Sigma).

8. Гентамицин (АО «Белмедпрепараты»).

9. Эмбриональная телячья сыворотка  (Flow).

10. Глутамин (Sigma).

11. Жидкостный сцинциляционный счетчик.

12. Фитогемагглютинин (Sigma). Маточный  раствор (1 мг/мл в RPMI-1640). Рабочий  раствор (5 мкг/мл в ПКС). Готовится  в день постановки.

13. Митоген лаконоса (Sigma). Маточный  раствор (1 мг/мл в RPMI-1640). Рабочий раствор (0,5 мкг/мл в ПКС). Готовится в день постановки.

14. ³[Н]-тимидин («Изотоп», Санкт-Петербург). Рабочий раствор (1 мкКи/мл). Размораживается один раз перед применением.

15. Сцинциляционная жидкость.

16. Стекловолоконные фильтры Titertek.

17. Полная культуральная среда  (ПКС).

 

 

Рис. 17. Стерильный ламинарный шкаф

 

 

Выполнение метода включает следующие  процедуры:

Выделение клеток. Используют мононуклеарные клетки из периферической крови человека или животного. Забор крови производят натощак в стерильную пробирку с гепарином (20 ME на 1 мл крови). От забора крови до начала выделения должно пройти не более 3 ч. Кровь в это время хранится при комнатной температуре в плотно закрытой пробирке. Перед разведением ее следует перемешать. Гепаринизированную кровь разводят в два раза средой 199, затем наслаивают на градиент плотности фиколл-пака (8 мл разведенной крови на 2 мл фиколла в центрифужной пробирке). Пробирки центрифугируют 30–40 мин при 400g. Затем отбирают образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров. После этого клетки дважды отмывают центрифугированием средой 199. Концентрацию клеток доводят до 2·10⁶ клеток/мл полной культуральной средой. Их жизнеспособность после выделения должна составлять не менее 95 %, что определяют по включению 0,2%-ного трипанового синего.

Постановка реакции. Мононуклеары культивируют в объеме 150 мкл ПКС (полной культуральной среды — питательная среда содержит все необходимые для культивирования компоненты: эмбриональную телячью сыворотку, 2-меркаптоэтанол, гентамицин) в 96-луночных круглодонных планшетах при 37 °C в атмосфере 5%-ного СО₂ в течение 72 ч в присутствии выше указанных митогенов в рабочих концентрациях. В качестве контроля используют клетки, инкубированные только в присутствии среды. За 6 ч до окончания реакции в каждую лунку добавляют Н³-тимидин в концентрации 1 мкКи на лунку. По окончании реакции клеточную взвесь переносят на стекловолоконные фильтры. Высушенные в течение ночи фильтры переносят в сцинциляционные флаконы с 3 мл сцинциляционной жидкости и подсчитывают включения радиоактивной метки: в культуре со средой: спонтанная бластгрансформация, с фитогемагглютинином — ФГА-индуцированная бласттрансформация, с митогеном лаконоса — МЛ-индуцированная бласттрансформация. Результаты выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции — отношение включения метки в присутствии митогена к включению метки в присутствии только среды.

Чувствительность и специфичность. Следует отметить, что данная методика разработана только для определенных митогенов, которые обладают неспецифическим воздействием на клетки, проводится in vitro, и у исследователя могут возникать вопросы при экстраполяции полученных при помощи данного теста результатов на реальное состояние Т- и В-звеньев иммунитета и иммунитета в целом. Для выявления специфического ответа лимфоцитов на антигены требуется более длительное (до 7 сут.) культивирование клеток. Поэтому сам по себе показатель активности лимфоцитов не должен служить единственным изучаемым критерием при клеточных иммунопатологиях самого различного генеза. Известно, что обусловленная терапией «нормализация митогензависимой активности» не обязательно развивается параллельно с улучшением клинической картины. Снижение пролиферативного ответа на митогены в большинстве случаев является косвенным доказательством наличия клеточного иммунодефицита, но механизмы последнего могут быть различными. Только в комплексе с другими количественными и, особенно, качественными характеристиками иммунной системы метод может дать наиболее полную информацию о состоянии иммунитета, выявлении конкретного иммунологического дефекта и, следовательно, подобрать адекватное лечение и/или способ иммунокоррекции.

Для высокой диагностической эффективности  и достаточной иммунокоррекции  следует соблюдать ниже приведенные условия и правила.

• Необходимо использовать инактивированную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС).

• Для большей информативности  этот анализ нужно проводить лишь в комплексе с другими показателями и оценкой клинической картины  в целом, а для исследования функциональной активности лимфоцитов — с синтезом цитокинов, определением активности ЕКК и др.

• Реальную информацию об изменении  параметра несут лишь сильные  сдвиги показателя (±20–40 % от нормы и более).

• Для диагностической и прогностической оценки иммунитета важнейшее значение имеет индивидуальный показатель нормы у данного больного (особенно с учетом возраста и наличия хронических заболеваний).

• При оценке функциональной активности лимфоцитов, как и при оценке других показателей иммунограммы, следует прежде всего исключить возможность их колебания в связи с приемом пищи, физическими нагрузками, стрессом, временем суток и др.

 

 

 

Определение активности естественных киллерных  клеток

 

Принцип метода. Определяется способность естественных киллерных клеток периферической крови убивать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562.

Необходимые реактивы:

1. Мононуклеары крови, выделенные  на фиколл-верографине.

2. Культура К-562.

3. Среда RPMI-1640.

4. Эмбриональная телячья сыворотка  (ЭТС).

5. Антибиотики.

6. ³Н-уридин.

7. Ламинарный шкаф (см. рис. 17).

8. Световой микроскоп.

9. Набор автоматических пипеток.

10. СО₂-инкубатор.

11. Центрифуга на 3000 об/мин.

12. Стерильные микропланшеты.

13. Жидкостный сцинциляционный счетчик.

 

Постановка метода:

1. Клетки-мишени [(1–4)·10⁶ кл/мл] метят Н³-уридином (1 мкКи/мл) и инкубируют при 37 °С на водяной бане 1 ч.

2. Меченые клетки трижды отмывают  большим объемом 
среды 199 с 10%-ной ЭТС.

3. Для предотвращения реутилизации  клетками-эффекторами продуктов  гидролиза ДНК, включившей радиоактивную метку, клетки-мишени инкубируют 2 ч при 37 °С и вновь отмывают один раз в большом объеме среды 199 с 10%-ной ЭТС.

4. Цитотоксический тест выполняют  в круглодонных 96-луночных планшетах.  В шесть лунок помещают клетки-мишени в количестве 1·10⁴ в 0,2 мл питательной среды (контрольные культуры). В другие шесть лунок помещают клетки-мишени в количестве 1·10⁴ в объеме 0,1 мл и клетки-эффекторы в количестве 5·10⁵ в 0,1мл. В каждую лунку добавляют панкреатическую РНКазу Serva в конечной концентрации 0,25–10,0 мкг/мл.

5. Культуры инкубируют 14 ч при  37 °C.

6. После инкубации клеточные  культуры переносят на фильтры  с помощью собирателя клеток  — харвестра.

7. Фильтры высушивают и помещают  в сцинтилляционную жидкость; проводят  учет реакции с помощью P-счетчика. Показатель активности ЕКК выражают в виде индекса цитотоксичности, который определяется по формуле:

 

ИЦ = среднее значение в опыте (имп/мин) .

        среднее значение  в контроле (имп/мин)

 

 

 

Реакция гиперчувствительности  замедленного типа in vivo (ГЗТ)

 

Клеточные реакции иммунной системы in vivo оцениваются по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа, отражающей функциональную активность Th1 (хелперов 1-го типа) и макрофагального звена при ответе на Т-зависимый антиген.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) состоит из двух этапов —  фазы сенсибилизации и разрешения. По результатам влияния на сенсибилизацию оценивается возможность образования  антигенспецифических Т-лимфоцитов, результаты разрешающей фазы оценивают интенсивность воспалительной реакции, связанной с выделением провоспалительных цитокинов.

Животных иммунизируют (сенсибилизируют) 2,5·10⁷ ЭБ/мышь внутрибрюшинно для тестирования интенсивности клеточного ответа — реакции гиперчувствительности замедленного типа. На 4-е сутки после сенсибилизации вводят разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (5·10⁸ ЭБ/мышь в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводят растворитель в том же объеме. Степень выраженности реакции ГЗТ оценивают по величине отека лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным (Crowle, 1975).

Учет реакции проводят через 24 ч  после введения разрешающей дозы ЭБ по величине местного отека; величину отека оценивают штангенциркулем. Результаты выражают в абсолютных (разности между отеком лапки, в которую были введены ЭБ, и отеком контралатеральной лапки) и относительных единицах (отношение разности между отеком лапки, в которую были введены ЭБ, и отеком контралатеральной лапки к отеку контралатеральной лапки, умноженное на 100 %).

 

 

Определение цитокинов

 

Термином «цитокины» объединяют так  называемые ростовые факторы, которые  регулируют пролиферацию, дифференцировку  и функцию клеток крови, в том  числе и клеток иммунной системы.

Цитокины представляют собой новую самостоятельную систему регуляции функций организма, обеспечивающую в первую очередь развитие защитных реакций и поддержание гомеостаза при внедрении патогенов (микроорганизмов) и нарушении целостности тканей, а также при эндогенно возникающих состояниях (опухолевые клетки, клетки, измененные вирусами, старением и т.д.).

Одним из важных показателей функционирования иммунной системы является оценка продукции  цитокинов. Оценивается как спонтанная, так и стимулированная митогенами продукция цитокинов in vitro клетками селезенки мышей методом иммуноферментного анализа.

Изучение уровней цитокинов  позволяет получить информацию о  функциональной активности различных  типов иммунокомпетентных клеток; о  тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, о соотношении процессов активации Т-хелперов 1-го и 2-го типов, о стадии развития ряда аллергических и аутоиммунных заболеваний. Оценка уровней цитокинов, в частности с использованием иммуноферментных диагностических тест-систем, позволяет по-новому подойти к изучению состояния иммунной системы организма в клинической практике.

Цитокины продуцируются и секретируются  клетками иммунной системы, они выполняют  функции ее медиаторов, обеспечивающих межклеточную кооперацию, позитивную и негативную иммунорегуляцию.

Цитокины регулируют амплитуду  и продолжительность воспалительного  и иммунного ответов, поэтому  они должны продуцироваться и  секретироваться транзиторно (индуцибельно), и иметь короткий полупериод жизни.

Классификация цитокинов в основном проводится по их биологическим свойствам.

• Интерлейкины (ИЛ) — факторы взаимодействия между лейкоцитами (гуморальная  связь между лейкоцитами);

• Интерфероны (ИФН) — цитокины с  противовирусной активностью (осуществляют естественную защиту организма от вирусов) — ИФН-α, -β, -γ.

• Факторы некроза опухоли (ФНОα) — обладают провоспалительными, гемопоэтическими и иммуностимулирующими свойствами.

• Колониестимулирующие факторы (КСФ) — гемопоэтические цитокины (способствуют продукции форменных элементов крови, лимфоцитов и макрофагов), вызывающие размножение и дифференцировку клеток-предшественников различных ростков гемопоэза на разных этапах их созревания, — Г-КСФ, М-КСФ, ГМ-КСФ.

• Хемокины (ХК) — хемотаксические  цитокины (ответственны за хемотаксис) — СС, CXC.

• Ростовые факторы — обладают противовоспалительным действием, способствуют регенерации поврежденных тканей.

Изучение уровня цитокинов (интерлейкинов) в сыворотке периферической крови и биологических жидкостях:

• провоспалительные цитокины — ИЛ-1, ФНОα;

• противовоспалительные цитокины ИЛ-4, ИЛ-10.

Количественное определение цитокинов  в культуральном супернатанте клеток селезенки проводится методом иммуноферментного  анализа с использованием соответствующих  тест-систем на иммуноферментном анализаторе «Мультискан». Расчеты количества цитокинов проводятся путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество цитокинов выражают в пкг/мл. Индекс стимуляции высчитывается как соотношение показателей индуцированной липополисахаридами и спонтанной продукции.

 

 

 

Оценка интерферонового  статуса

 

При возникновении инфекции в организме  человека развиваются иммунные реакции  со сложными клеточными взаимодействиями. Регуляторами этих взаимодействий являются специальные белки — цитокины. Одним из ключевых цитокинов является интерферон.

Спектр основных биологических  эффектов ИФН:

• подавление размножения внутриклеточных  инфекционных агентов вирусной и  невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие);

• антипролиферативная активность;

• антитуморогенный эффект;