Фармакогностическое изучение листьев ореха грецкого и маркетинговые исследования антимикробных препаратов

На нижней стороне листа клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками, аномоцитный тип устьичного аппарата (рис. 7).

Рисунок 7 – Нижняя эпидерма

 

На краю листовой пластинки расположено  множество волосков (рис. 8), а вдоль жилок расположены остроконечные одноклеточные толстостенные волоски (рис. 9).

При более крупном увеличении хорошо различима форма друз в кристаллической обкладке (рис. 10) и четырёхклеточное строение эфиромасличной желёзки (рис.11).

На поперечном срезе черешка  (после окраски флороглюцином и концентрированной хлористоводородной кислотой) хорошо видны элементы проводящей системы – сосуды ксилемы и ситовидные трубки (лубяные волокна), а для черешкового эпидермиса характерны головчатые волоски.

Рисунок 8 – Край листовой пластинки: видны многочисленные волоски

Рисунок 9 – Остроконечные одноклеточные толстостенные волоски

Рисунок 10 Вид листа с нижней стороны: эфиромасличные желёзки и устьица.

Рисунок 11 – Участок жилки с кристаллоносной обкладкой

 

Рисунок 12 – Поперечный срез черешка

Рисунок 13 – Головчатый волосок эпидермиса черешка

Выводы по главе

Диагностическое значение для листьев ореха грецкого имеют следующие признаки:

• клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками, аномоцитный тип устьичного аппарата;
• эфиромасличные желёзки с 4-8 радиально расположенными клетками,
• друзы оксалата кальция в палисадной паренхиме вдоль жилок (кристаллическая обкладка),
• остроконечные одноклеточные толстостенные волоски, чаще пучками по жилкам и железистые на 1-2-клеточной ножке с многоклеточной головкой.

 

3. ФИТОХИМИЧЕСКИЙ И ТОВАРОВЕДЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛИСТЬЕВ ОРЕХА ГРЕЦКОГО

1. Определение некоторых числовых показателей сырья

Изучение числовых показателей сырья проводили по методикам ГФ XI и XII издания [21, 29].

Определение золы: около 3—5 г измельченного лекарственного растительного сырья (точная навеска) помещали в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый тигель, равномерно распределяя вещество по дну тигля. Затем тигель осторожно нагревали, давая сначала сырью сгореть при возможно более низкой температуре. После того как уголь сгорел почти полностью, увеличивали нагрев.

При неполном сгорании частиц угля остаток  охлаждали, смачивали водой или насыщенным раствором аммония нитрата, выпаривали на водяной бане и остаток прокаливали. В случае необходимости такую операцию повторяли несколько раз.

Прокаливание  вели при слабом красном калении (около 500 °С) до постоянной массы, избегая сплавления золы и спекания её со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждали в эксикаторе и взвешивали.

Определение влажности: аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц около 10 мм, перемешивали и брали две навески массой 3—5 г, взвешенные с погрешностью ±0,01 г. Каждую навеску помешали в предварительно высушенную и взвешенную вместе с крышкой бюксу и ставили в нагретый до 100—105°C сушильный шкаф. Время высушивания отсчитывали с того момента, когда температура в сушильном шкафу вновь достигала 100— 105°С. Первое взвешивание листьев, проводили через 2 ч. Высушивание проводили до постоянной массы. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями после 30 мин высушивания и 30 мин охлаждения в эксикаторе не превышает 0,01 г.

Определение потери в массе при  высушивании для пересчета количества действующих веществ и золы на абсолютно сухое сырьё проводили в навесках 1—2 г (точная навеска), взятых из аналитической пробы, предназначенной для определения содержания золы и действующих веществ вышеописанным методом, но при разнице между взвешиваниями, не превышающей 0,0005 г.

Влажность сырья (X) в процентах вычисляли по формуле:

где m — масса сырья до высушивания в граммах; m₁ — масса сырья после высушивания в граммах.

За окончательный результат  определения принимают среднее  арифметическое двух параллельных определений, вычисленных до десятых долей процента. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0,5%.

Определение содержания экстрактивных  веществ: около 1 г измельченного сырья (точная навеска), просеянного сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 200—250 мл, прибавляли 50 мл растворителя, указанного в соответствующей нормативно-технической документации на лекарственное растительное сырьё, колбу закрывали пробкой, взвешивали (с погрешностью ±0,01 г) и оставляли на 1 ч. Затем колбу соединяли с обратным холодильником, нагревали, поддерживая слабое кипение в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывали той же пробкой, взвешивали и потерю в массе восполняли растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 150—200 мл, 25 мл фильтрата пипеткой переносят в предварительно высушенную при температуре 100—105°С до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 7—9 см и выпаривали на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушили при температуре 100— 105°С до постоянной массы, затем охлаждали в течение 30 мин в эксикаторе, на дно которого помещён безводный хлорид кальция, и немедленно взвешивали.

Содержание экстрактивных веществ  в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырьё вычисляли по формуле:

где т — масса сухого остатка в граммах; m₁ — масса сырья в граммах; W потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Результаты эксперимента представлены в таблице 13.

Таблица 1 – Результаты товароведческого анализа листьев ореха грецкого

Показатель	% (среднее значение)
Влажность	8,0
Зола общая	7,86
Экстрактивные вещества, извлекаемые спиртом этиловым хлороформом гексаном	21,74 10,48 10,03

 

Таким образом, нами были определены основные числовые показатели листьев ореха грецкого.

2. Качественный анализ биологически активных веществ листьев ореха грецкого методами ТСХ и денситометрии

Качественный анализ мы проводили  методом тонкослойной хроматографии.

Методика: листья ореха измельчали до размера частиц 3мм. Около 0,5 г экстрагировали 20 мл хлороформа на водяной бане, снабженной обратным холодильником. Полученное извлечение наносили на хроматографическую пластинку «Сорбфил», предварительно проведя линию старта, и хроматографировали в системе растворителей петролейный эфир - диэтиловый эфир в соотношении 5:2 в герметичной камере. По достижении растворителем 3-ёх см до края пластинки её извлекали и отмечали линию финиша. Идентификацию хлорофилла проводили по характерному свечению в УФ-свете, каротиноиды – обработкой хроматограммы раствором фосфорно-молибденовой кислоты (синие окрашивание), юглон по собственной окраске. Результаты качественного анализа подтверждали методом препративной хроматографии с последющим элиюрованием зон адсорбции и спектрофотометрической идентификацией соединений.

Содержание основных действующих  веществ мы определяли в хлороформном извлечении методом денситометрии. Полученные нами изображения хроматограмм обрабатывали компьютерной программой Videodensitometr.

Денситометр предназначен для расчета параметров и количественной оценки результатов анализов в тонкослойной хроматографии.

Денситометр состоит из осветительной камеры (дневной свет, УФ-254, УФ-365), цветной  видеокамеры, платы ввода и захвата  изображения, компьютера, монитора, (принтера), программы количественной оценки и расчета параметров в тонкослойной хроматографии.

Денситометр производит расчет видеоизображения пластины с построением хроматограммы трека (аналоговой кривой) по отклонению яркости (интенсивности окраски) пятен в треке от яркости фона пластины с последующим нахождением пиков на этой кривой и расчетом их площади. При количественном расчете хроматограммы исходят из положения, что размеры и яркость пятна (площадь пика) есть функция количества вещества в пятне.

Результаты эксперимента представлены на рисунке и в таблице 2.

Рисунок 14 – Денситограмма хлороформного извлечения из листьев ореха грецкого

 

Таблица 2 – Результаты денситометрического  анализа

Пик	Rf	S	%S	H	%H	Содержание в % в ЛРС
1	0,06 (неидентиф.)	110954	11,6	8157	16,4	0,17
2	0,12 (неидентиф.)	118226	12,4	8388	16,8	0,18
3	0,38 (юглон)	271255	28,5	12406	24,9	0,42
4	0,49 (хлорофилл)	321731	33,7	14601	29,3	0,50
5	0,83 (β-каротин)	131160	13,8	6256	12,6	0,20

 

Таким образом, нами проведен качественный количественный анализ основных действующих веществ липофильной фракции листьев ореха грецкого, которые представлены юглоном, хлорофиллом и β-каротином.

3. Количественный анализ основных биологически активных

веществ листьев ореха грецкого

Юглон и его гликозиды имеют жёлто-оранжевый (при разведении - жёлтый) цвет, поэтому возможно их количественное определение по интенсивности собственной окраски. Для разработки методики количественного определения использовали растворы РСО юглона различной концентрации в хлороформе.

Для выбора оптимальной длины волны  измеряли оптическую плотность раствора юглона в хлороформе относительно чистого хлороформа на фотометре КФК-3-01 в интервале длин волн 315-600 нм с шагом 5 нм. По полученным значениям был построен график зависимости оптической плотности от длины волны, представленный на рисунке 15.

 

Рисунок 15 – График зависимости оптической плотности раствора юглона в хлороформе от длины волны в диапазоне 310-600 нм

Оптимальной длиной волны при фотометрическом измерении является участок, где выполняются следующие условия: 1) оптическая плотность имеет максимальную величину; 2) ход кривой примерно параллелен горизонтальной оси, то есть оптическая плотность слабо зависит от длины волны.

Таким образом, при фотометрическом  анализе хлороформного раствора юглона оптимальной длиной волны является 430 нм, при которой мы и проводили дальнейшие измерения.

Для определения линейности метода строили график зависимости оптической плотности от концентрации юглона по данным, представленным в таблице 3.

Таблица 3 – Исходные данные для построения зависимости

оптической плотности от концентрации юглона

Концентрация юглона, % (X)	Оптическая плотность (Y)
0,0008	0,172
0,0016	0,319
0,0024	0,452
0,0032	0,603

По полученным данным строили градуировочный график, определяли характер зависимости и рассчитывали статистические характеристики. Кривая регрессии и величина достоверности аппроксимации R² были определены при помощи Microsoft Excel и представлена на рисунке 16.

 

 

Рисунок 16 – Зависимость оптической плотности от концентрации юглона

Полученные значения указывают  на то, что данная зависимость имеет  линейный характер, что позволяет  использовать её для расчетов при  количественном определении юглона фотоколориметрическим методом.

Нами предложена следующая методика определения суммы нафтохинонов в листьях ореха грецкого в пересчёте на юглон: около 0,2 г (точная навеска) измельчённых листьев ореха грецкого помещали в термостойкую колбу вместимостью 100 мл, заливали 15 мл хлороформа и нагревали на водяной бане 15 мин. Извлечение охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл, операцию проводили дважды. Извлечение доводили до метки хлороформом_, перемешивали. Измеряли оптическую плотность полученного раствора. На КФК-3-01 в кювете толщиной слоя 10 мм при λ = 430 нм относительно чистого растворителя. Содержание (X%) суммы нафтохинонов в пересчёте на юглон и абсолютно сухое сырьё проводили с использованием ранее построенного калибровачного графика по формуле: