Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

                           А                                                                                              Б

                                                                               В

Рис.1.2. Типы стволовых клеток

А - Фетальная стволовая клетка

Б -  Стволовая клетка пуповинной крови

В – Стволовые клетки костного мозга

                      В процессе взросления человека наблюдается катастрофическое снижение количества стволовых клеток: при рождении - 1 стволовая клетка встречается на 10 тысяч, к 20 - 25 годам - 1 на 100 тысяч, к 30 - 1 на 300 тысяч. К 50-летнему возрасту в организме уже остается всего 1 стволовая клетка на 500 тысяч, причем именно в этом возрасте, как правило, уже появляются такие болезни, как атеросклероз, стенокардия, гипертония и т.д.
                    Истощение запаса стволовых клеток вследствие старения или тяжёлых заболеваний, а так же нарушение механизма их выброса в кровь, лишает организм возможностей эффективной регенерации, в результате чего жизнедеятельность тех или иных органов истощается.

Рис. 1.3.    Классификация и распространение стволовых клеток.

                              1.3. Свойства стволовых клеток.

Стволовые клетки (СК) занимают централь­ное место в клеточном гомеостазе организма, прежде всего потому, что их основной функцией является восполнение естественной потери клеток, выполняющих специализированные функции. Согласно наиболее принятой характеристике, СК - это особая группа недифференцированных кле­ток, обладающих двумя фундаментальными свой­ствами: способностью к самовоспроизведению и к дифференцировке в специализированные тка­ни. Кроме того, к основным свойствам СК можно отнести значительный пролиферативный потен­циал, позволяющий им многократно делиться и сохраняться как популяции в течение, как прави­ло, всей жизни организма. Следует, однако, ого­вориться, что под СК в научной литературе также понимают и полученные ex. vivo популяции кле­ток, идентичность которых клеткам, существую­щим in vivo, не доказана и часто вовсе неочевидна. Необходимый критерий отнесения такого рода клеток к СК - их нормальное функционирование, согласно общепринятым критериям, в качестве стволовых или дифференцированных клеток по­сле введения в организм, включая  и нервную  систему  (Лосева, 2001,   Hofstetter  et al., 2002).

Взрослый организм млекопитающих, включая человека, состоит более чем из 200 типов клеток, развивающихся из трех зародышевых листков. Способность клеток одного и того же вида давать начало разным типам клеток и тканей называет­ся плюрипотентностью. (Рис.1.4.) Плюрипотентность - од­на из основных характеристик всех СК. Опреде­ленные клетки позвоночных на ранних стадиях эмбриогенеза обладают способностью диффе­ренцироваться во все типы клеток и тканей. В ча­стности, клетки внутренней массы бластоцисты млекопитающих дают начало всем типам клеток взрослого организма. Такая особенность называ­ется  тотипотентностью.

Рис.1.4. Плюрипотентные стволовые клетки

                    Особое  удивление  биологов  вызвало  наличие  стволовых  клеток  в  центральной  нервной  системе.  Они  отвечают  на  различные  поражения  нервной  ткани  размножением   (сами  нервные  клетки,  как известно,  утрачивают  способность  к  размножению уже  на стадии  нейробласта)  и  дифференцировкой  в  нервные и  глиальные  клетки  (Gage  et al., 1995,  Корочкин, 2001). Делящиеся  клетки  в  центральной  нервной   системе  встречали  довольно  давно, однако  такие  клетки  ошибочно принимали  за  нервные, и  соответствующие  работы  вызывали  законное  сомнение, поскольку   утрата  нейронами  способности  к  делению была  твердо  установлена.  Изолированные   нейральные  РСК   способны  превращаться  и в  другие  производные  (Gage  et  al., 1995),  хотя  многочисленные  данные,  свидетельствующие  об  этом, рекомендуется  тщательно  перепроверять. (Рис.1.5.)

                    В последние годы опубликовано значительное число работ, указывающих на новую фундамен­тальную особенность соматических СК, а имен­но, способность СК, дающих начало клеткам тка­ни определенного типа, в определенных условиях дифференцироваться в клетки других, "неродст­венных" типов тканей, даже если они онтогенети­чески принадлежат разным зародышевым лист­кам. Это свойство названо пластичностью, а сам процесс дифференцировки в "несвойственный" тип клеток часто называют трансдифференцировкой или, что более корректно, трансдетерми­нацией. Например установлено, что СК костного мозга, происходящие из мезодермы, способны дифференцироваться в клетки нейрональной тка­ни, берущие начало из эктодермы, а также в ряд других тканей (Krause D.S., et  al., 2001; Brazelton T.R.,   et al., 2000; Mezey E., et  al., 2000) и, напротив, нейрональные СК, полученные из взрослого головного мозга, могут дифференцироваться в гемопоэтические клетки (Bjornson C.R., et  al.,1999). Эти работы породили определенную эйфорию среди исследователей, работающих с СК, и вызвали появление новой концепции, со­гласно которой все соматические СК обладают крайне широкой пластичностью и способны, при наличии подходящего микроокружения, диффе­ренцироваться в любые типы клеток (Theise N.D., et  al., 2002). Ряд по­следующих публикаций, однако, показал, что с переходом на новую парадигму для СК стоит по­временить. Также в настоящее время известны публикации свидетельствующие о том, что мезенхимные СК костного мозга отличаются очень широкой пластичностью. Мезенхимные СК способны давать начало некоторым эле­ментам нервной ткани, гепатоцитам, кардиомиоцитам, эпителиальным клеткам легких (Ortiz L.A., et  al., 2003; Clarke D., et  al., 2001; Colter D.C., et  al., 2000; Ballas C.B., et  al., 2002; Pittenger M.F., et  al., 2001; Kopen G.C., et  al., 1999; Woodbury D., et al., 2000; Makino S., et al., 1999; Kim D.H., et al.,2003). При культивировании МСК, однако, воз­можна некоторая потеря мультипотентности (Mauraglia A., et al., 2000) что, по-видимому, объясняется неоднород­ностью популяции, содержащей в норме клетки-предшественники с ограниченным потенциалом дифференцировки (Pittenger M.F., et al., 1999). В последние годы начи­нают проясняться молекулярные механизмы, ле­жащие в основе необычно широкой пластичнос­ти Мезенхимных СК.

                    Исследователи, считающие пластичность СК реально существующим явлением, кроме экспериментов ex vivo, указывают на работы, в которых наблюдаемые изменения судь­бы трансплантированных клеток костного мозга, по-видимому, не вызваны их слиянием с клетками органа-мишени (Newsome P.N., et al., 2003; Ianus A. et al., 2003; Ishikawa F., et al., 2003; LaBarge M.A., et al., 2002).Среди приверженцев пластичности СК постепенно вырабатывается консенсус, состоящий в том, что пластичность су­ществует в действительности, но наблюдается, прежде всего, при повреждениях органов и тканей. Так, значительное увеличение степени включения инъецированных клеток в орган происходит при повреждении легких и мышц (Ortiz L.A., et al., 2003; LaBarge M.A., et al., 2002). До недавнего времени практически не было данных о том, что полипотентные  СК млекопитающих, например, гемопоэтические СК, могут изменять направление своего развития и дать начало клеткам кожи, печени или любым другим специализированным клеткам, отличных от форменных элементов крови.  Обнаружилось, что некоторые СК животных, при некоторых условиях могут менять свою специализацию. Так, СК нервной ткани мыши, введенные в костный мозг, оказались способными дифференцироваться в разные клетки крови, а СК, обнаруженные в костном мозге крыс, могут дифференцироваться в клетки печени. Эти эксперименты свидетельствуют о том,  что при определенных  условиях СК проявляют большую гибкость.

  Рис.1.5. Основные источники стволовых клеток (www.stem-cells.ru)

1.4. Особенности  региональных  нейральных  стволовых  клеток

                    Открытие стволовых клеток в нервной системе явилось важным событием в современной неврологии (Gage et al., 1995).  Оно вызвало переоценку целого ряда устоявшихся представлений,  в особенности касающихся восстановительных процессов в центральной нервной системе. Стволовая клетка в нервной системе характеризуется теми же основными  свойствами,  что и стволовая клетка вообще,  а именно  -  сохранением способности к делению (которая утрачивается у нейронов уже на стадии нейробласта) и  плюрипотентностью, т.е. возможностью дифференцироваться в различных направлениях,  притом, по-видимому,  не только в нейральном. Известны молекулярные маркеры,  позволяющие идентифицировать как стволовые нервные клетки,  так и последовательные фазы их развития (Gage et al., 1995).  Это -  нестин для стволовой клетки,  виментин – для  клетки-предшественника,  бета-тубулин – для нейробласта,  GFAP  (кислый глиальный фибриллярный белок) – для клетки, дифференцирующейся в направлении глиального

развития  и т.д.

                 Следует отметить еще одну особенность популяции,  содержащей стволовые клетки,  - ее гетерогенность.  Например,  типичные   распределения специфических иммуногистохимических маркеров в популяции фетальных стволовых  нервных клеток человека таково  (в процентах): нестин  - 43.1, виментин - 63.2, бета-тубулин 70.1, GFAP - 3.2, NCAM - 12.0, CD34 (маркер гематогенных стволовых клеток) - 1.3, CD45 (антиген лейкоцитов) - 0.5.  Эта  гетерогенность,  по крайней мере, в какой-то степени,  определяет специфику реакции стволовых клеток на различного рода внешние воздействия:  в частности,  изменения процентного соотношения клеток с разными потенциями  отражается на характере их дифференцировки при попадании в различную микросреду. Естественно,  что больший процент нестин-содержащих клеток будет способствовать более эффективному воздействию  микроокружения на дальнейшую судьбу дифференцирующихся   клеток.   Интересным примером такой специфической реакции является  дифференцировка  ксенотрансплантатов стволовых нервных клеток эмбрионов дрозофилы (Александрова и др., 2000; Корочкин, 2000).

Установлено,  что нервные  стволовые  клетки  характеризуются    выраженным  консерватизмом,  так  что  человеческие  стволовые  клетки  способны  мигрировать и  развиваться  в случае  их  трансплантации   в  мозг  крысы.  Более того,  в экспериментах (Корочкин, 2000, Александрова и др., 2000) было  показано,  что  даже  нервные  стволовые  клетки  дрозофилы  способны  дифференцироваться  в  случае  их  ксенотрансплантации в мозг  столь  отдаленного  таксона  как  крыса.

                    Так же оказалось,  что   нервные  стволовые  клетки  дрозофилы  не  только  переживают,  но  и  мигрируют  и  дифференцируются  в  мозге  крысы  (Корочкин, 2000). Они специфически реагируют на  нейротро-фические факторы,  синтезируемые  генами  человека.  Так,   при  ксено-трансплантации  клеток  трансгенной  линии  дрозофилы,  содержащей ген gdnf,  в  дифференцирующихся   стволовых  нервных  клетках  дрозофилы  отмечался  выраженный  синтез тирозингидроксилазы, а клетки с геном ngf активно продуцировали  ацетилхолинэстеразу.   Сходные  синтезы  ксенотрансплантат индуцировал  в  пересаживаемом  в  комбинации   с  ним аллотрансплантате  эмбриональной  нервной  ткани  (Pavlova G. et all. 2003 г.).  Следовательно,  важную  роль  в  специфичности  дифференцировки  стволовых  нервных  клеток  играют  нейротрофические  факторы,  которые,  возможно,  в  числе  прочих  моментов,  дают  сигнал,  определяющий,  детерминирующий  направление  развития  стволовых  клеток.  При этом ксенотрансплантат,  продуцирующий нейротрофические факторы оказывает специфический эффект на судьбу аллотрансплантатов, которые развивались в этом случае значительно более интенсивно и в 2-3 раза превосходили по размерам  аллотрансплантаты,  введенные в мозг без добавления ксенотрансплантатов. Следовательно, клетки ксенотрансплантата,  содержащие гены нейротрофинов,  в частности ген,  кодирующий человеческий глия-производный нейротрофический фактор, оказывают на развитие аллотрансплантата эффект,  подобный соответствующему нейротрофину.  Так,  например,  показано,  что  GDNF  специфически повышает выживаемость дофаминэргических нейронов эмбрионального среднего мозга крыс,   а также усиливает  метаболизм дофамина этими клетками (Lin et al., 1993).  GDNF также значительно повышает уровень дифференцировки тирозингидроксилаза-положительных клеток, усиливая рост аксонов и увеличивая размеров тела клеток.  Сходные эффекты наблюдаются и в культуре дофаминэргических нейронов среднего мозга крысы (Lin et al., 1993).

                    При ксенотрансплантации  эмбриональных стволовых нервных клеток  человека в мозг взрослых крыс наблюдалась их активная миграция (Gershon, 1997; Корочкин, 2000). При этом процесс  миграции  стволовых  нервных  клеток   контролируется  набором  специальных  генов     (Gershon, 1997; Корочкин, 2000). В частности, сигналом, запускающим этот процесс, является белковый продукт протоонкогена  c-ret совместно с  GDNF. Следующий сигнал поступает от гена  Mash-1,  который является  гомологом  комплексу achaete-scute дрозофилы,  управляющему выбором пути развития клетки.  Специфическая реакция дифференцирующихся клеток зависит также от  альфа-рецептора цилиарного нейротрофического фактора  (Gershon, 1997).

                    Во многих случаях развития нервной системы клетки                                                                                                                                                                                                                                                                                     вступившие на путь нейрального развития мигрируют в различные области центральной и периферической нервной системы и претерпевают последовательные фазы дифференцировки, вплоть до терминальной.

По-видимому,  среди мигрирующих нейробластов могут  крайне редко оказаться и клетки на более ранней стадии становления (вероятно предшественники),  сохраняющие способность к митотическому делению.

                 1.5. Стволовые клетки  как  удобная  модель  для  анализа роли генов  в  процессе дифференцировки

Плюрипотентность стволовых клеток (как РСК, так и ЭСК) делает их весьма удобной модель­ной системой для изучения молекулярно-генетических событий, обусловливающих дифференцировку клеток в разных направлениях. Действительно, стволовые клетки можно изолировать, так ска­зать, в чистом виде и затем анализировать функ­ции генных сетей на последовательных этапах их дифференциального развития (Davidson E. et al., 2001)

Оказалось, в частности, что время последова­тельного включения генов, контролирующих развитие, совпадает в постимплантационных за­родышах и в культуре эмбриоидных тел (Leahy A. et al.,1999 и Репин В.С.и др.2002). Следовательно,стволовые клетки могут служить удобной экспери-ментальной моделью для уточ­нения молекулярно-генетических процессов, со­провождающих клеточную специализацию.

Анализ культур стволовых клеток с помощью молекулярно-генетического микроэррэй - метода продемонстрировал, что в одном клоне мезенхимных стволовых клеток синтезируется по край­ней мере 1200 матричных РНК (Tremain N. et al., 2001). В разных ство­ловых клетках присутствует похожий набор пред-синтезированных матричных РНК-копий многих генов (Kelly D. et al., 2000). При этом удалось выяснить, что, как и случае дифференцировки в составе целостного эмбриона (Корочкин Л.И., 2002), в мезенхимных стволовых клеток взрослой гематогенной ткани содержится прак­тически весь набор матричных РНК, которые функционируют в зародышевых листках и на ста­дии органогенеза. Идентифицированы также ма­тричные РНК ключевых генов, регулирующих созревание клеток мезенхимального и мезодермального происхождения, а также энтодермы и экто­дермы. Большинство матричных РНК НОХ-генов присутствует уже в яйцеклетке и презумптивных зародышевых клетках (Репин В.С. и др. 2002).