Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

Государственное  образовательное  учреждение  высшего  и профессионального образования

Московский Педагогический Государственный Университет

Кафедра основ сельского хозяйства и генетики

Канайкина   Надежда   Николаевна

Студентка 5 курса, 4 группы

Получение и исследование стволовых клеток трансформированных геном красного флуоресцентного белка

Дипломная работа

                                                     Научный руководитель:

                                                            доц., к.б.н. Мазяркина Т. В.

                                                                     доктор медицинских наук

член-корреспондент РАН

проф. Корочкин Л. И.

                                   Рецензент:

доц., к.б.н. Стволинская Н.С.

                                           Москва 2005 год

Содержание

                                  Введение

                    От фундаментальной науки не принято ожидать сиюминутного практического выхода. Но светящиеся и цветные белки привлекли внимание сразу же после их открытия.   Было исследовано, что экворин, главный компонент флуоресцентных белков стали применять в качестве индикатора ионов кальция в клетке. Эти ионы кальция присутствуют в самых разных клетках.  С повышением  их концентрации в цитоплазме запускается множество клеточных процессов: мышечные и немышечные сокращения, синаптическая передача нервных импульсов, всевозможные виды клеточной секреции, иммунные реакции фагоцитов, клеточные деления и т. д. С помощью подобного индикатора можно следить за всеми перечисленными событиями в клетке. Именно светящиеся белки кишечнополостных животных из класса Hydrozoa - экворин и обелин - положили начало новой эре в биофизике клетки.  Затем генные инженеры и биотехнологи занялись флуоресцирующими белками, точнее, их генами. В качестве генетического маркера первым начали применять ген GFP из водоросли эквореи, соединяя его с генами других белков или вводя его матричную РНК во всевозможные клетки. Учеными было установлено, что таким способом можно сделать видимыми (во флуоресцентном микроскопе) места и скорость образования любых белков, прослеживать рост клеточных клонов, включая, патогенные бактерии и раковые опухоли. Удается также наблюдать за размножением в подопытном организме разных вирусов, в том числе тех, которые содержат не ДНК, а РНК, т.е. ретровирусов, например, иммунодефицита человека.

                     К 2002 г. количество работ с применением GFP в качестве генетического маркера превысило 9000.В последнее время этот маркер стали применять в комплексе с геном белка нестина, характерного для стволовых клеток мозга. Благодаря данным работам была опровергнута незыблемая, казалось бы, догма о неспособности нервных клеток восстанавливаться. Оказалось, что их самообновление за счет дифференцирующихся стволовых клеток осуществляется даже у взрослых животных, включая человека. По проведенным опытам  во флуоресцентном микроскопе на срезах мозга трансгенных мышей с зеленой нестин/GFP меткой прекрасно видны флуоресцирующие пятна в ряде областей.  После того как был клонирован GFP из A.victoria, возникла необходимость обогатить палитру применяемых цветных маркеров, чтобы в одном опыте метить флуоресцентными метками сразу несколько генов. Попытки добиться этого путем мутагенеза гена GFP, пересаженного в кишечную палочку, имели весьма ограниченный эффект. От исходного дикого типа с максимумом свечения в 508 нм появились слабосветящийся “голубой” мутант с максимумом в 440 нм, а также “красный” мутант с максимумом в 526 нм, где свет все равно зеленый.

                    Открыв, цветные белки, ученые получили возможность метить ими клеточные клоны, вводя в них матричные РНК таких белков. Многоцветные метки, то есть их применение особенно перспективно в так называемом методе индуктивно-резонансного переноса энергии (frequence-resonance-energy transfer - FRET). Впервые освоенный с использованием разноцветных мутантов GFP из эквореи, этот метод позволил наблюдать межбелковые взаимодействия. Чтобы увидеть контакты между белковыми молекулами, один их тип метят сравнительно коротковолновой флуоресцентной меткой, например зеленой (максимум излучения на 508 нм), а другой - длинноволновой, скажем, с красной флуоресценцией (излучением 583 нм), возбуждаемой зеленым светом. Если облучить объект ультрафиолетовым или синим светом, флуоресценция будет зеленой только до тех пор, пока первый из меченых белков не соединится со вторым. Когда эти белки вступят в контакт, флуоресценция станет красной из-за нерадиационной миграции энергии с первой метки на вторую. Так можно изучать взаимодействия антитела с антигеном, вирусного белка и связываемого им белка “хозяина”, молекулярного рецептора с белковым гормоном и т.д. Можно наблюдать разрушение белка ферментами протеазамии. Другое применение разноцветных белков - автоматическая сортировка клеток по цвету в проточно-капиллярном цитометре. От красного белка все той же красной дискактинии получен мутант, который по мере созревания за 16 ч меняет цвет флуоресценции с зеленого на красный. Если эмбрион пометить геном такого белка, то можно видеть, где ген начал работать раньше (т.е. стал синтезироваться сам белок), а где - позже. Об этом свидетельствует последовательное появление  пятен зеленой, далее пятен красной флуоресцентной окраски.
      Со временем, возможно,  исследователям удастся даже генетически красить в разные яркие цвета - флуоресцентные и нефлуоресцентные - декоративные растения, аквариумных рыбок (это уже удалось сотрудникам Сингапурского зоопарка) и, что куда важней, овец и пушных животных. И тогда, например, могут появиться овцы с наследуемой рубиновой, изумрудной или бирюзовой шерстью. Много и других перспектив. Правда, есть одна методическая трудность. Открытые  белки, в отличие от зеленого флуоресцирующего белка из эквореи, имеют тенденцию слипаться в уже выделенном виде в димеры, тетрамеры и даже в большие агрегаты. А это затрудняет их применение в методе FRET и может быть даже вредно для исследуемых клеток. Однако в последнее время эта трудность успешно преодолевается - специалисты научились получать неслипающиеся мутантные варианты GFP-подобных белков.

                   Цель:

                    Целью данной работы является   создание генно-инженерных конструкций, содержащих гены флуоресцентных белков и использование флуоресцентных белков в качестве маркеров, исследование работы данных конструкций в культуре  нейральных стволовых клеток. Для данной цели были использованы  гены природных флуоресцентных белков, выделенных из водоросли Aequorea victoria

Задачи:

1.      Получение генно-инженерных конструкций, содержащих ген красного        флуоресцентного белка и ген зеленого флуоресцентного белка под контролем цитомегаловирусного промотора (CMV).

2.      Электропарация  эмбриональных стволовых клеток данными конструкциями и исследование  экспрессии флуоресцентных белков.

3.      Исследование токсичности данных белков для культуры стволовых клеток.

4.      Изучение вероятности использования данной системы стволовых клеток, меченных флуоресцентными белками, для трансплантации.

Обзор литературы

                                 1.  Стволовые клетки.

                             1.1. Понятие о   стволовых   клетках.     

                   В течение многих лет исследователи пытают­ся понять, каким образом живой организм под­держивает гомеостаз, как восстанавливается по­сле повреждения и какие механизмы участвуют в замене поврежденных клеток здоровыми. Направленное использование механизмов самопод­держания позволило бы коренным образом изме­нить наши подходы к терапии многих болезней. (Р. А. Мусина, Е. Е. Егоров, 2004)

                    В процессе жизни многоклеточного организма происходит постоянный процесс отмирания клеток. Для того чтобы количество клеток оставалось постоянным, в организме должен быть резерв клеток для замены. Роль такого резерва выполняют камбиальные и стволовые клетки.

                    Действительно, стволовые клетки – прародительницы всех без исключения типов клеток в организме. Они способны к самообновлению и, что самое главное, в процессе деления образуют специализированные клетки различных тканей. Таким образом, все клетки составляющие основу нашего организма возникают из стволовых клеток.
                    Стволовые клетки обновляют и замещают клетки, утраченные в результате каких-либо повреждений во всех органах и тканях. Они призваны восстанавливать и регенерировать организм человека с момента его рождения.
                    Стволовые  клетки  -  это клетки, сохраняющие  потенциал  к  развитию  в  разных  направлениях.   Из  стволовой  клетки   могут  возникнуть  и   кожная, и  нервная  клетки, и  клетки  крови  (Lovell-Badge, 2001, Сухих, Малайцев, 2001, Корочкин, 2003) (Рис.1.1.).    Считалось, что  во  взрослом  организме  стволовые  клетки  отсутствуют,  что  их   существование  ограничивается  самым  ранним  периодом  эмбрионального  развития.  Однако   в 70-е  году  А.Я. Фриденштейн   с  соавторами    обнаружили  эти  клетки  в  мезенхиме    (строме) костного  мозга (Friedenstein, 1974). По принадлежности  к  строме  их  в  дальнейшем  стали  называть  стромальными  стволовыми  клетками.   В 70-е годы были  опубликованы  работы,  демонстрировавшие наличие  стволовых клеток практически  во  всех  органах   взрослых  животных и  человека  (Викторов,  2001).

Рис.1.1. Направления развития стволовых клеток (www.stem-cells.ru)

                    Потенциал стволовых клеток только начинает использоваться наукой. Ученые надеются в ближайшем будущем создавать из них ткани и целые органы, необходимые больным для трансплантации взамен донорских органов. Их преимущество в том, что их можно вырастить из клеток самого пациента, и они не будут вызывать отторжения.

                   1.2. Классификация стволовых клеток.

По своему происхождению стволовые клетки разделяют на эмбриональные, фетальные, стволовые клетки пуповинной крови и стволовые клетки взрослого человека (соматические клетки).
                    Источником эмбриональных стволовых клеток является бластоциста – зародыш, который формируется к пятому дню оплодотворения. Эти стволовые клетки способны дифференцироваться абсолютно во все типы клеток взрослого организма, они составляют строительный материал для развития органов и тканей в эмбриогенезе.

Фетальные стволовые клетки. Получают их из 6-21-недельных плодов, извлеченных во время операции по искусственному прерыванию беременности. Несмотря на то, что применяются они с 1961 года и в мире накоплен уже достаточно солидный опыт, споры вокруг использования фетальных стволовых клеток ведутся еще более жаркие – к противникам стволовых клеток присоединяются еще и противники абортов. (Рис.1.2.,а)

                    Стволовые клетки пуповинной крови, заготовка которых происходит во время родов. Эти клетки более специализированы, в основном – это кроветворные стволовые клетки, из которых затем разовьются эритроциты, лейкоциты и другие форменные элементы крови. (Рис.1.2.,б)

                    Стволовые клетки взрослого организма, или соматические СК, представляют собой клетки различного типа, локализованные в специализированных тканях и органах. Они обнаружены в крови, костном мозге, скелетных мышцах, роговице и сетчатке глаза, пульпе зубов, головном и спинном мозге, крове­носных сосудах, печени, коже, желудочно-кишеч­ном тракте, поджелудочной железе.

                   Самым доступным источником стволовых клеток является костный мозг человека, так как концентрация стволовых клеток в нем максимальная. (Рис.1.2.,в) В костном мозге выделяют сразу два вида стволовых клеток: первый - это гематопоэтические стволовые клетки, из которых формируются абсолютно все клетки крови, второй - это мезенхимальные стволовые клетки, которые регенерируют практически все органы и ткани. (Рис.1.3.)