Иммунологические методы диагностики

кисленко  В.Н.

 

 

 

 

Иммунологические методы диагностики

 

 

 

 

электронный учебный  ресурс

 

 

 

новосибирск- 2010

 

 

Разнообразие форм иммунного  ответа предопределяет широкий набор методов их регистрации. Однако каждой форме иммунологического реагирования соответствует только свой, определенный набор методов исследования, что важно знать для правильного подбора методов тестирования иммунного состояния организма.

Условно все методы можно разделить  на две большие группы: прямые методы выявления патогена, когда лаборатория стремится выделить фрагмент возбудителя (наследственный материал или антигены) или с помощью культурального посева обнаружить патогены на искусственных питательных средах, и непрямые. К прямым методам диагностики следует отнести бактериологический анализ, микроскопию и иммунофлуоресценцию и различные методы ДНК-диагностики (в первую очередь — амплификационные и гибридизационные технологии). К непрямым методам относятся гистология, инструментальный анализ и, конечно, серологический анализ, то есть анализ гуморального ответа организма на присутствие патогена.

Оценка гемограммы (относительное  и абсолютное количество лимфоцитов, лейкоцитов и эритроцитов). Оценку иммунного статуса следует начать с изучения параметров периферической крови: подсчета общего количества лейкоцитов и эритроцитов в 1 мл крови и подсчета мононуклеарных клеток в мазке. Эти данные позволят оценить относительное (%) и абсолютное количество лимфоцитов в 1 мл крови.

Оценка гуморального звена иммунной системы. Исследование гуморального звена иммунной системы (антительный ответ, В-клеточный ответ иммунной системы) включает в себя оценку В-лимфоцитов (общее содержание в крови, анализ антигенных детерминант) и вырабатываемых ими антител (разных классов иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA, IgE), а также определение количества антителообразующих клеток (АОК) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

При регистрации антителообразования  учитывается наличие циркулирующих  в крови и лимфе антител, секреторных, или местных, образующихся локально слизистыми покровами, и антител, содержащихся в клетках-продуцентах. Возможно также оценить способность В-клеток синтезировать антитела в культуре in vitro.

Определение антител, иммуноглобулинов разных классов. Определение иммуноглобулинов — один из наиболее распространенных методов исследования гуморального иммунитета. Для количественной оценки иммуноглобулинов сыворотки крови чаще всего используют методы: 1) радиальной иммунодиффузии; 2) иммуноэлектрофореза; 3) метод иммунофлуоресценции.

Практически все методы исследования гуморального иммунитета основаны на учете строго специфической реакции антиген-антитело, причем при постановке теста один из участников этой реакции известен, а наличие другого предполагается. В результате реакции между антигеном и антителом образуются иммунные комплексы антиген-антитело, которые так или иначе обеспечивают обезвреживание и нейтрализацию чужеродного антигена. Если образовавшиеся молекулярные агрегаты антиген-антитело имеют достаточно большие размеры, они выпадают в осадок — происходит их преципитация. В том случае, когда антиген представлен чужеродной клеткой (эритроцит, бактерия), в результате образования на ее поверхности комплекса антиген-антитело изменяются физико-химические свойства клеточной мембраны и, при условии крупных размеров антитела (IgM), происходит «склеивание» (агглютинация) клеток. Если же антитело имеет относительно малые размеры (например IgG), то образовавшийся на поверхности клетки иммунный комплекс не способен вызвать их агглютинацию. В этом случае речь идет о так называемых неполных антителах, которые блокируют чужеродные антигены так, что они не могут взаимодействовать с полными антителами. Агглютинацию таких клеток можно вызвать, добавив к ним так называемые гетерологические антитела, т.е. антитела против иммуноглобулинов человека (например, реакция Кумбса — см. ниже). Для идентификации иммунных комплексов часто используют их свойства образовывать преципитаты (выпадать в осадок) или агглютинировать различные клетки или частицы (например, эритроциты, частицы латекса и т.д.).

Наибольшей точностью обладают методы, основанные на обнаружении  и клинической оценке меток (маркеров), располагающихся на участвующих  в иммунной реакции антителах (радиоактивные  вещества, изотопы, ферменты, флюорохром): радиоиммунный, иммуноферментный и метод иммунофлуоресценции.

Сывороточные антитела представлены преимущественно IgG и IgM, которые взаимодействуют  в основном с растворимыми и корпускулярными  антигенами соответственно. Следовательно, антитела, ассоциированные с IgG, можно  обнаружить при помощи реакций, основанных па феномене преципитации, а связанные с IgM — при помощи реакций, основанных на феномене агглютинации. Антитела, участвующие в формировании феномена преципитации (преципитины), выявляют в реакциях кольцевой преципитации (пробирочная) и преципитации в гелях (пластинчатая). В обоих вариантах ингредиенты реакции должны быть прозрачными, чтобы визуально зарегистрировать образовавшийся преципитат в виде кольца на границе двух сред при постановке пробирочной РП (реакция преципитации) или в виде линий между лунками с реагентами при постановке реакции диффузионной преципитации (РДП).

Антитела, участвующие в формировании феномена агглютинации (агглютинины), выявляют в реакциях агглютинации —  пробирочной, пластинчатой, кольцевой  в различных вариантах. Агглютинат обычно хорошо виден глазом в форме беловато-сероватых трудно разбиваемых при встряхивании комочков. Для выявления агглютининов в молоке реакцию ставят с подкрашенным антигеном.

Для повышения чувствительности серологических (лат. serum — сыворотка) реакций обычно растворимые антигены закрепляют на какой-либо крупной частице, получая искусственный корпускулярный антиген (например, в реакциях латекс-агглютинации или непрямой гемагглютинации), или вводят вторую, индикаторную систему (например, в реакции связывания комплемента).

Во всех этих реакциях уровень антител  определяют в титрах, принимая за последний  наибольшее разведение сыворотки, обеспечивающее положительный результат реакции.

 

 

 

Глава 1. Применение серологических реакций для диагностики инфекционных болезней и идентификации микроорганизмов

 

Иммунологические реакции in vitro (в пробирке) используют в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний и иммунологических исследованиях. Метод диагностики инфекционных заболеваний, основанный на определении специфических антител в сыворотке крови, называется серологическим.

Серологические реакции применяют  в двух направлениях:

• Выявление с диагностической  целью антител в сыворотке  крови обследуемого при наличии  набора известных антигенов. В качестве антигенов применяют взвеси микроорганизмов, инактивированные химическими или физическими методами, или используют диагностикумы, представляющие фракции микроорганизма. Как правило, результаты серологической диагностики получают при исследовании парных сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через определенные промежутки времени от начала заболевания.

• Определение родовой, видовой  и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов с известными иммунными сыворотками. Иммунные сыворотки должны содержать антитела в высоком титре и быть строго специфичными. В лабораторной практике применяют серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация) и опосредованные реакции (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента), а также реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флуоресцирующих антител).

Процесс взаимодействия антигена с  антителом протекает в две фазы.

Специфическая фаза — это взаимодействие, при котором происходит комплементарное  соединение активных центров антител  и антигенов. Процесс длится от нескольких секунд до нескольких минут. Специфической  фаза названа потому, что с антигеном, попавшим в организм, может соединиться только подходящее к нему (комплементарное) антитело.

Неспецифическая фаза — это проявление внешних признаков образования  иммунных комплексов (помутнение, выпадение  осадка и так далее). Длится от нескольких минут до нескольких часов.

Внешние проявления реакции антитело-антиген  зависят от многих факторов: от физико-химических свойств антигена (размеры, физическое состояние), от класса и вида антител, от условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, pH, температура). Поливалентность (способность образовывать больше двух связей) антител и антигенов обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это можно объяснить тем, что к образовавшемуся комплексу антиген-антитело могут присоединяться другие молекулы антител и антигенов на свободные активные центры. В результате формируются довольно крупные агрегаты, которые могут выпасть в осадок.

Еще одной особенностью является то, что наиболее интенсивно реакции  антиген-антитело проявляются, если компоненты находятся в эквивалентных соотношениях, то есть лишних антител и антигенов после реагирования не остается.

Иммунологические реакции благодаря  высокой специфичности и чувствительности применяют для выявления и  количественного определения антигенов  и антител. Для выявления неизвестного антигена используют диагностические иммунные антисыворотки. Их получают путем многократной иммунизации лабораторных животных известным антигеном. Обнаружение антител проводят с использованием известных антигенов, которые представляют собой взвесь убитых микроорганизмов, инактивированных высокой температурой, химическими веществами, ультразвуком, рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым облучением.

 

 

Реакция агглютинации

 

Реакции агглютинации — это реакции  склеивания корпускулярных антигенов (микробы, эритроциты и т.д.) специфическими антителами. Образовавшийся при этом комплекс выпадает в осадок. Эти реакции проводят для определения наличия определенных антигенов или антител. На стекле к капле сыворотки добавляется взвесь бактерий, выделенных из организма или трупа.

Если капля мутнеет, значит, агглютинация произошла и в организме присутствует тот антиген, к которому были антитела (известные) в исходной сыворотке. Также  эту реакцию проводят в пробирке: в несколько пробирок наливают исследуемую сыворотку крови с неизвестными антителами, потом к этим образцам добавляют известные диагностикумы (убитые бактерии) и наблюдают, в какой пробирке произойдет помутнение или выпадет осадок.

Реакция агглютинации — взаимодействие антител с антигенами — является двухфазной: в первой фазе происходит специфическое связывание антигена и антитела, во второй — осаждение образовавшегося агрегата, являющегося гидрофобным, солями. Основываясь на этом представлении, принято разделять агглютинины на полные и неполные. Неполные антитела — агглютинины, которые в среде физиологического раствора NaCl не могут осаждать клетки или частицы, даже если они связываются с ними. Классификация агглютининов, основанная на методах их выявления:

• полные агглютинины;

• неполные агглютинины:

– блокирующие антитела, определяемые в тесте блокирования,

– агглютиноиды, определяемые в среде  сыворотки, плазмы, альбумина,

– неполные антитела, выявляемые с  помощью антиглобулиновой реакции  — Coombs,

– криптагглютиноиды, выявляемые после предварительной обработки эритроцитов ферментами,

– агглоиды, обнаруживаемые с помощью  коллоидных посредников (поливинилпирролидон, желатина, декстран и др.).

Полные и неполные агглютинины  находятся в основном в γ-глобулиновой фракции сыворотки крови. В процессе иммунизации вначале появляются полные антитела, в случае продолжающейся сенсибилизации появляются антитела, способные вызвать агглютинацию лишь при определенных условиях.

Полные и неполные антитела имеют  отличительные признаки по физико-химическим свойствам и серологической характеристике. Так, неполные антитела более термостабильны по сравнению с полными, в то время полные менее устойчивы и снижают свою активность даже при хранении в замороженном состоянии. Полные антитела имеют большую авидность к соответствующим антигенам, чем неполные антитела.

 

 

Реакция гемагглютинации (агглютинация эритроцитов)

 

Реакция агглютинации широко используется для обнаружения антиэритроцитарных антител (определение групп крови), а также антигенов в исследуемых  образцах эритроцитов или тканей с помощью специфических антисывороток.

Агглютинация в солевой  среде — наиболее простой метод выявления полных агглютининов, реакцию можно проводить как на планшетах (более быстрый метод), так и в пробирках (для более точного количественного учета антител в сыворотке).

Для реакции необходимы исследуемая  сыворотка или сыворотка известной  специфичности и взвесь эритроцитов, приготовленная из свежевзятой крови, отмытой от примеси плазмы физиологическим  раствором NaCl. С этой целью в пробирку с 8–10 мл физиологического раствора NaCl берут несколько капель крови, перемешивают и центрифугируют в течение 5–7 мин при 3000 об/мин. Затем сливают надосадочную жидкость, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор до нужного объема, перемешивают путем встряхивания и вновь центрифугируют. После троекратного отмывания из осадка эритроцитов готовят 2–5%-ную взвесь эритроцитов в физиологическом растворе хлористого натрия.

Агглютинация в пробирках (планшете для агглютинации). В ряд агглютинационных пробирок (кроме первой) вносят по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора. Затем в первую и вторую пробирки добавляют по 0,1мл (2 капли) сыворотки и, начиная со второй пробирки, переносят после перемешивания пипеткой по 0,1 мл (2 капли) разведенной сыворотки в каждую последующую пробирку, получая, таким образом, ряд разведений сыворотки, кратных 2. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл (1 капля) 2% взвеси эритроцитов. В качестве контроля берут нормальную сыворотку и физиологический раствор с используемой взвесью эритроцитов.