Шпаргалка по «Вирусологии»

8. Особенности репродукции бактериофагов. В репродукции фагов различают пять стадий. 1. Адсорбция на оболочке микробной клетки и растворение ее. Фаги адсорбируются (прикрепляются) к поверхностям клеток бактерий своими петушками отростков; нити (жгутики) прочно соединяются с рецепторами клеточных стенок. При этом в результате взаимодействия с поверхностью клетки происходит сокращение отростка фага, и он внедряется внутрь бактерии. При адсорбции отростка фага происходит растворение оболочки клетки лизоцимом, выделяемым фагом. 2. Впрыскивание ДНК фага внутрь микробной клетки. В бактериальную клетку проникают вся нуклеиновая кислота и незначительная часть белка отростка фага. З. Латентный (скрытый) период репродукции фага. В этот период происходит синтез фаговых нуклеиновых кислот и белков. Проникшая ДНК фага подавляет метаболизм бактериальной Клетки: клетка начинает синтезировать новые частицы ДНК фага и продуцировать белок. Таким образом, синтез самой бактериальной ДНК прекращается и подавляется синтез большинства ферментов бактерий. В этот период фаг внутри бактериальной клетки нельзя обнаружить, он как бы исчезает. 4. Образование новых фаговых частиц. Происходит соединение двух составляющих фаговых компонентов путем заполнения белкового чехла частицами ДНК. 5. Растворение оболочки бактериальной клетки и выход вновь образованных фаговых частиц наружу. Разрыву оболочки клетки способствуют сильное повышение внутриклеточного давления и ферментативные процессы, вызванные фагами. Число воспроизведенных фагов у разных клеток различно — от единиц до тысячи. Весь процесс репродукции протекает в течение 3... 10 ч в зависимости от вида фага. Число фагов определяют титрованием на диких и плотных питательных средах. Для этого материал, содержащий бактериофаг, разводят в нисходящих дозах (от 1: 10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10000, 1: 1000000 и т.д.). К каждому разведению прибавляют одинаковый объем суточной бульонной культуры соответствующих бактерий и выдерживают в термостате. Титр фага определяют по просветлению бульона в последней пробирке, где отсутствует рост бактериальной культуры. Таким образом, за титр бактериофага принимают его наибольшее разведение или наименьшее количество, способное вызывать растворение бактерий.

9. Устойчивость вирусов к физико-химическим факторам. Разные группы вирусов обладают неодинаковой устойчивостью во внешней среде. Наименее устойчивы вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, наиболее устойчивы изометрические вирусы. Так ортомиксовирусы и парамиксовирусы инактивируются на поверхностях за несколько часов, тогда как вирусы полиомиелита, адено-, реовирусы сохраняют инфекционную активность несколько дней. Однако из этого правила имеются и исключения. Так, вирус оспы устойчив к высыханию и сохраняется в экскретах многие недели и месяцы. Вирус гепатита В устойчив к действию неблагоприятных внешних факторов и сохраняет свою активность в сыворотке даже при кратковременном кипячении. Чувствительность вирусов к ультрафиолетовому и рентгеновскому облучению зависит преимущественно от размеров их генома. Чувствительность вирусов к формальдегиду и другим химическим веществам, инактивирующим генетический материал, зависит от многих условий, среди которых следует назвать плотность упаковки нуклеиновой кислоты в белковый футляр, размеры генома, наличие или отсутствие внешних оболочек. Вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, чувствительны к эфиру, хлороформу и детергентам, в то время как просто устроенные изометрические и палочковидные вирусы устойчивы к их действию. Важной особенность вирусов является чувствительность к РН. Есть вирусы, устойчивые к кислым значениям РН (2,2-3,0), например вирусы, вызывающие кишечные инфекции и проникающие в организм алиментарным путем. Однако большинство вирусов инактивируется при кислых и щелочных значениях РН.

10. Культивирование вирусов на  ж-х. Культивирование вирусов производят для накопления вируссодержащего материала с целью изучения иммунобиологических, антигенных, морфологических и других свойств вирусов, а также для приготовления биологических препаратов (вакцин, гипериммунных сывороток и др.). Известно, что вирусы являются облигатными паразитами, т. е. репродуцируются только внутри живых клеток. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ НА ЕСТЕСТВЕННО-ВОСПРИИМЧИВЫХ И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ. Последовательные пассажи вирусов на восприимчивых животных способствуют их репродукции и усилению патогенности. Влияют на чувствительность животных к вирусам следующие факторы. 1. Возраст. Наиболее восприимчивы молодые животные — (мышата, крольчата и др.), так как у них нет совершенной системы защиты организма. Однако эмбрионы некоторых животных, находясь в утробе матери, начинают вырабатывать специфические антитела. Например, эмбрионы крупного рогатого скота с 6-месячного возраста вырабатывают антитела. 2. Наличие неспецифических ингибиторов, которые повышают защитную функцию организма. В организме молодых животных низкое содержание ингибиторов, но с возрастом их концентрация увеличивается и соответственно повышается сопротивляемость организма к вирусам. 3. Пол животных. Наиболее чувствительны особи женского пола — самки (болезнь Марека), менее — мужского пола (самцы). 4. Генетические линии. Одни животные более чувствительны, другие — резистентны. Перед заражением всех животных выдерживают в карантине в течение 2-3 нед. В этот период за ними ведут клиническое наблюдение, ежедневно двукратно измеряют температуру тела, проводят бактериологические, серологические и гематологические исследования для исключения инфекционных и паразитарных болезней. Для культивирования вирусов используют только животных клинически здоровых, одного возраста и породы, из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям. В последние годы как за рубежом, так и в нашей стране начали использовать для культивирования гнотобиотов (безмикробных, стерильных животных). Метод заражения подопытных животных. Животных подбирают с учетом тропизма культивируемого вируса (к данному виду). При культивировании нейротропных вирусов, развивающихся в клетках нервной системы, животных заражают в головной мозг (фиксированный вирус бешенства, нейротропные штаммы вируса Ньюкаслской болезни, вирус энцефаломиелита лошадей, шотландского энцефалита овец, болезни Ауески, или псевдобешенства, и др.). Наиболее восприимчивы к большинству нейротропных вирусов мьши, поэтому пассажи чаще проводят на белых мышах. Зараженных животных в период ясно выраженной клинической картины болезни убивают эфиром или хлороформом, тушки де инфицируют растворами дезсредств. Затем с головы животного отделяют кожу, вскрывают черепную коробку, извлекают головной мозг, помещают его в стерильную баночку или пробирку, или чашку Петри. От мозга каждого животного отрезают маленький кусочек и помещают в пробирку с сахарным бульоном для контроля на бактериальную загрязненность. Через 2-3 сут после просмотра посевов из стерильных образцов вирусного материала готовят 10%-ю суспензию для заражения очередной партии подопытных животных (следующий пассаж вируса). При культивировании пяевмотропных вирусов (инфекционная плевропневмония коз, инфлюэнца свиней, грипп и др.) в качестве вируссодержащего материала используют легкие, смывы из носовой и ротовой полостей и зева. Из них готовят 10%-ю суспензию на фосфатном буфере, затем центрифугируют при сравнительно малых оборотах (2000-3000 мин - надосадочную жидкость используют для заражения животных интраназальным или интратрахеальным способами. У животных, заболевших после заражения с типичной клинической картиной, в качестве вируссодержащего материала берут легкие. При пантропных инфекциях (чума свиней, классическая чума птиц, чума крупного рогатого скота, африканская чума свиней и др.) используют в качестве вируссодержащего материала кровь, селезенку, печень, лимфатические железы больных животных, которые извлекают с соблюдением условий стерильности. Из органов и тканей готовят соответствующую суспензию, которую при меняют для последующего заражения внутривенным или подкожным методами. Для культивирования дерматропных вирусов (оспа овец и птиц, ящур, ларинготрахеит птиц, эктима овец и др.) используют пораженные участки кожи больного животного, суспензию из везикул и пустул (при оспе, ящуре), из оспенных эпителиом или дифтеритических клеток (при оспе, дифтерите птиц) или материал, взятый из трахеи (при ларинготрахеите птиц). Вируссодержащий материал лабораторным животным вводится внутрикожно. Культивирование вирусов в организме животных имеет недостатки: 1) не все вирусы культивируются в организме лабораторных животных; 2) лабораторные животные потенциально могут быть носителями различных скрытых инфекционных заболеваний; 3) материальные затраты на кормление, содержание животных. 

11. Культивирование на куриных  эмбрионах. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В РАЗВИВАЮЩИХСЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах наиболее совершенный метод. Впервые был применен Раусом в 1911 г. для выделения вируса саркомы белых мышей. В 1931 г. Вудраффом и Гудласчером заразили хорион-аллантоисную оболочку куриного эмбриона вирусом оспы птиц. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, осповакцина, оспа птиц, ларинготрахеит и др.), успешно развиваются на хорион-аллантоисной оболочке, вызывая макроскопически види мые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп А, В и С, Ньюкаслская болезнь, классическая чума птиц, эпидемический паротит, инфекционный бронхит птиц, вирусный гепатит утят, арбовирусы и др.) хорошо репродуцируются в курином эмбрионе при введении их в аллантоисную полость. Некоторые крупные вирусы культивируются в желточном мешке эмбриона, вакцинные штаммы вируса чумы крупного рогатого скота репродуцируются в эмбрионе при внутривенном его заражении. Культивирование в куриных эмбрионах — наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения многих вирусов животных, так и для последующего культивирования их в лаборатории. В основе метода лежит удаление эмбриона (деэмбринирование) из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорион-аллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образуется своеобразная культура ткани, в которой может репродуцироваться вирус. Метод обладает рядом преимуществ, так как позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала, а отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител способствует размножению некоторых видов вирусов. Для культивирования используют живые куриные эмбрионы 5-15-суточного возраста. На размножение вирусов в них существенное влияние оказывают температура инкубации, возраст эмбрионов, метод заражения и количество введенного вируса. Многие вирусы (чумы птиц, гриппа, герпеса и др.) активно репродуцируются при температуре от 32 до 37 °С. Некоторые специально селекционированные штаммы удовлетворяет более низкая температура (23-28 °С), но скорость репродукции при этом значительно ниже. При 39-40 ос вирусы размножаются быстрее, а при 41-42 °С, как правило, они не размножаются. Наиболее активно накапливается вирус при введении в эмбрион 1000-10 000 инфекционных доз. Существует несколько способов заражения куриных эмбрионов: 1) на хорион-аллантоисную оболочку; 2) в аллантоисную полость; 3) в амниотическую полость; 4) в желточный мешок. После введения вируса все зараженные эмбрионы помещают в термостат для инкубирования. Максимальное накопление вируса происходит в течение 24.. .96 ч в зависимости от его вида. Эмбрионы погибают, после чего их вскрывают, собирают вируссодержащий материал. Недостатки метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах: 1) куриные эмбрионы могут быть носителями микроорганизмов (сальмонеллы, туберкулезная палочка), в том числе вирусов (лейкоз птиц, бронхит кур и др.) и противовирусных антител; 2) не все вирусы культивируются в куриных эмбрионах. Культивирование вирусов в деэмбрионированных яйцах — удобный метод для изучения динамики изменения гемагглютининов в зараженном яйце, а также противовирусных свойств различных препаратов.

12. Культивирование вирусов на культуре клеток. По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяются на:

1. первичные, способные размножаться только  на первых генерациях, т.е. в нескольких  пассажах после выделения из  тканей;

2. Диплоидные  клеточные штаммы, полуперевиваемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40 - 100 пассажей).

3. Клеточные  линии, перевиваемые, или стабильные, способные размножаться в лабораторных  условиях неопределенно длительный  срок посредством постоянного  пассирования;

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчение ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующем суспендированием клеток в питательной среде.

Этапы получения первичной культуры.

1. Берут  ткань молодого животного (лучше  всего эмбриона).

2. Кусочки  ткани отмывают от эритроцитов  в растворе Хенкса.

3. Кусочки  ткани заливают теплым раствором  трипсина на растворе Хэнкса.

4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.

5. Проводят  дробную трипсинизацию.

6. Раствор  трипсина сливают в центрифужные  пробирки. В растворе находятся  отдельные клетки.

7. Центрифугация  в течении 10 минут - 1000 об/мин, затем  трипсин сливают.

8. Клетки  помещают в питательную среду:

9. Культивирование  вирусов в культуре клеток .

Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде (`матрасы', флаконы, пробирки и др.).

Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению.

Диплоидные клеточные штаммы –это клеточные линии, в которых до 75% клеток имеет кариотип нормальных клеток исходного типа и способные сохранять исходный диплоидный набор хромосом в течение 40 - 100 пассажей. В процессе пассирования культуры клеток, часть клеток может терять один тип хромосом и приобретать другой, то есть кариотип этих диплоидных клеток отличается от исходного. При этом некоторые возможности вирусного генома реализуются лишь в клетках с исходным кариотипом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека широко используются в диагностической вирусологии и при производстве вакцин.

Популяция, в которой менее 75% клеток с исходным диплоидным набором – это линия гетероплоидных клеток.

Перевиваемые клеточные линии, перевиваемыеоднослойные культуры клеток приготавливают из злокачественных или нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa , первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep - 3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, CV-1, почек обезьян, BHK-21 хомячка, и др. Это трансформированные клетки, трансформация которых вызвана экспрессией в норме не используемого, или нового введенного извне генетического материала. При этом источник нового генного материала должен быть известен. Перевиваемые клеточные линии, как правило, теряют большинство свойств исходных клеток, и по их морфологическим и биохимическим показателям часто невозможно определить их происхождение.

13. Общие физиологические факторы естественного противовирусного иммунитета. Факторы неспецифического и специфического противовирусного иммунитета. Учение о противовирусном иммунитете является частным разделом современной иммунологии, которая занимается изучением механизмов защиты, обеспечивающих постоянство внутренней среды организма путем распознавания и взаимодействия с чуждым ему субстратом. Особенность иммунологии вирусных инфекций обусловлена уникальными особенностями биологии их возбудителей, принадлежащих к агентам молекулярной неклеточной организации. Все вирусы представляют собой строгие внутриклеточные паразиты, отличающиеся механизмами репродукции и взаимодействия с чувствительными клетками от клеточных микроорганизмов. Своеобразие биологии вирусов и патогенеза болезней, вызываемых ими у животных и человека, непосредственно отражается на иммунологических реакциях, соответствующих каждой отдельной группе вирусных инфекций.

При вирусных инфекциях, как и при бактериальных, после переболевания в организме формируется иммунитет различной напряженности и длительности. Следует отметить, что при попадании вируса в организме не всегда происходят иммунологические реакции. Этот вид невосприимчивости свойствен животным определенного вида к определенному возбудителю инфекции и передается из поколения в поколение, например лошади не болеют ящуром, крупный рогатый скот — сапом, собаки — чумой свиней и др. В основе механизмов такой невосприимчивости (врожденного иммунитета — видового, наследственного, генетического) к определенным возбудителям лежит отсутствие в клетках рецепторов и субстратов, необходимых для взаимодействия вирусов, наличие веществ, блокирующих репродукции вирусов. Последние не могут репродуцироваться в организме, и заболевание не происходит. Необходимо отметить, что у новорожденных во многих случаях видовая устойчивость отсутствует, например крольчата-сосуны и мышата чувствительны к заражению вирусом ящура.