Шпаргалка по «Вирусологии»

2.  Внесение  антигенов. В лунки планшета, сенсибилизированные  специфическими антителами, вносят  контрольные положительные и  отрицательные антигены и исследуемую  пробу в разведении от 1 : 10 до 1 : 1280, инкубируют в термостате при 37 °С в течение 1 ч. По истечении срока инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от несвязавшихся с антителом антигенов и подсушивают на фильтровальной бумаге.

3. Внесение  пероксидазного антивидового конъюгата  в рабочем разведении с целью выявления комплекса «антиген + антитело». Залитые планшеты помещают в термостат при 37 °С на 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают физиологическим раствором и подсушивают.

4. Внесение  субстратной смеси. Для проявления  реакции в лунки планшета вносят раствор субстрата (индикатора пероксида-зы) — ортофенилдиамина, к раствору которого добавляют 3%-й раствор пероксида водорода для выявления комплекса «антиген +

+ антитело + конъюгат». Планшеты закрывают  и оставляют в темном месте  при комнатной температуре на 15...30 мин.

5. Учет реакции  проводят визуально или спектрофотометричес-ки. При визуальной оценке реакции  учет проводят по 4-плюсовой

системе:

++++ — интенсивное  оранжевое окрашивание;

+++ — оранжевое  окрашивание;

++ — бледно-оранжевое  окрашивание;

+ — желтое  окрашивание.

Пробу считают положительной при оценке в два креста (++) и более. За титр антигена принимают то ее наивысшее разведение, при котором в реакции со специфическим антителом наблюдается бледно-оранжевое окрашивание (++), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.

При спектрофотометрическом учете результатов реакции проводят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном (ОП[) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП2). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1, и отрицательной,

если ниже 2,1.

Постановка иммуноферментного метода для обнаружения (или титрования) антител такая же, как при обнаружении и идентификации вируса антигена, но с той разницей, что материалом служит исследуемая сыворотка крови.

43. Полимеразная цепная реакция. ПЦР. Благодаря высокой чувствительности метод ПЦР требует специально оборудованных помещений и тщательного соблюдения техники безопасности во избежание контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК приводит к амллификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к получению ложноположительных результатов. Ложноположительный результат может быть вызван наличием ингибиторов реакции, недостаточной чувствительностью реакции, ошибками при выделении ДНК и др. Поэтому в каждой серии анализов должен присутствовать положительный контроль- образец с заведомым присутствием участка ДНК для данных праймеров. Лаборатория, где проводится ПЦР, требует территориального разделения на три зоны для выполнения отдельных процедур: 1) первая зона предназначена для приготовления ПЦР-реактивов; 2) во второй зоне проводят выделение ДНК из клинических образцов и постановку ПЦР; 3) третья зона предназначена для детекции продуктов амплификации. Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от первой зоны ко второй и далее к третьей. При исследовании материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением Санитарных правил СП- 1.2.011 —94 (безопасность работы с микроорганизмами I...II групп патогенности). Забор клинических образцов осуществляют только в одноразовые пластиковые пробирка, работают в одноразовых перчатках, используют одноразовые пипетки. Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом в течение 1 ч до и после окончания работы. Метод ПЦР. Принцип метода заключается в том, что по данным банка генов выявляют специфический для данного вируса ген — участок молекулы ДНК, несущий информацию для синтеза одного белка. Этот ген затем идентифицируют в исследуемом материале с помощью ПЦР. Полимеразная цепная реакция позволяет амплифицировать (образовывать дополнительные копии гена) в пробирке заданный участок ДНК-вируса. Амплифицируемый участок называют «амплификат», границы которого определяются двумя олигонуклеотидными праймерами, комплементарным начальным участком противонаправленных нитей двойной спирали ДНК. ПЦР является специфичной и высокочувствительной реакцией, что обусловлено последовательностью нуклеотидов избранного гена. В зависимости от цели исследования можно выявить вид или род микроорганизма. Суть ПЦР заключается в том, что молекулу ДНК подвергают температурному плавлению, т. е. нагреванию до 90-94 °С что ведет к денатурации — разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали, а затем охлаждают (отжиг) до 52 С в присутствии праймера, фермента ДНК-полимеразы и всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов. Последующее повышение температуры до 70-72 С приводит к синтезу новой молекулы ДНК, комплементарной матричной. Эту процедуру (плавленая, отжига и синтеза ДНК) повторяют многократно, в результате чего количество выбранного фрагмента ДНК увеличивается. Продолжительность реакции обусловлена числом циклов, не обходимых для синтеза ДНК в количестве, достаточном для дальнейшего исследования или индикации. Индикацию проводят с помощью электрофореза или меченого ДНК зонда. Основные компоненты: 1) ДНК-полимераза 1, термостабальная, выдерживающая многократный нагрев до 96 С. 2) праймер — олигонуклеотид из 15-20 нуклеотидов. Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе, пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК; 3) нуклеотид — трифосфаты (d NTR), предшественника синтеза ДНК; 4) приборы (амплифакатор и др.), посуда и реактивы для электрофореза в агаровом геле, проявления полос нуклеиовых кислот при ультрафиолетовом освещении, автоматические пипетка и др. В настоящее время выпускают специальные наборы для ПЦР, предназначенные для диагностика инфекционных болезней животных. Обычно один набор компонентов для анализа содержит 100 образцов. Постановка полимеразной цепной реакции включает несколько этапов. 1. Получение ДНК-образца (лизатов, исследуемого материала). Для этого исследуемый материал суспендируют в буфере или дистиллированной воде, добавляют 1 М раствор NаОН и выдерживают при 37С 6-7 мин. Смесь нейтрализуют добавлением трис (оксаметил) аминометана (рН 8,0). Лизат центрифугируют при 5000 мин в -1 степени в течение 10 мин для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК и РНК, используют для постановки ПЦР. 2. Проведение полимеразной цепной реакции — амплификация заданного фрагмента ДНК (гена). Для этого используют буферный раствор [буфер для ПЦР (10х) —500 мМ КСI, 100 мМ трис — НСl, 14, 15 мМ MgCl, 0,1 % желатина или бычьего сывороточного альбумина, рН 8], фермент ДНК-полимеразу, праймер-олигонуклеотид — затравку, трифосфаты — предшественники синтеза ДНК, исследуемый образец ДНК или биологическую жидкость (кровь, меча, слюна, мокрота и др.). В пробирку емкостью 1,5 мл собирают следующую смесь: 125 мкл бидистиллированной стерильной воды, 15 мкл буфера для ПЦР, 5 мкл раствора трифосфатов, З мкл раствора праймера, З мкл раствора ДНК-полимеразы термостойкой. Смесь разливают в пять пробирок (вместимостью 0,5 мл) по ЗО мкл. В каждую из них вносят по 0,5-1,0 мкл надосадочной жидкости из лизата, перемешивают; сверху наслаивают по 25 мкл стерильного вазелинового масла. Включают амплификатор и устанавливают режим работы. Например, плавление: температура 92 С в течение 60 с; отжиг ДНК: 55 С в течение 60 с; синтез ДНК: 70 С в течение 75 с. В стадии «плавления» пробирки устанавливают в амплификатор; проводят ЗО циклов амплификации, что занимает З ч, и за этот срок из одной молекулы ДНК образуется до 1 млн молекул-копий. Реакцию останавливают на стадии «синтеза» и выдерживают З-5 мин для окончательного досинтезирования фрагментов ДНК. З. Индикация амплификата. С этой целью пробу подвергают электрофорезу в агарозном геле для разделения молекул ДНК. На пластинку наносят пробы, подлежащие анализу, и соответствующие свидетели. После разделения ДНК на электрофореограмме резко выделяется амплифицированная молекула. Для электрофореза готовят 1,7%-й раствор агарозы с этидкум бромидом (краска); раствор заливают в аппарат для электрофореза, устанавливают шаблон для образования лунок. Через 25-З0 мин агароза полимеризуется, шаблон осторожно вынимают, при этом в агарозе образуются лунки. В аппарат заливают буфер для электрофореза и устанавливают электроды. Из полученного при полимеразной цепной реакции амплификата отбирают 10 мкл смеси и смешивают с 5 мкл красителя — бромфенолового синего. Смесь вносят в лунки и проводят электрофорез в режиме 5 В/см. Через 40-45 мин аппарат отключают, агарозную пластинку вынимают и 10 мин окрашивают в растворе этидиум бромида. Затем агарозу помещают на трасиллюминатор и полученные картины полос фотографируют. Полосы, выявляемые при ультрафиолетовом освещении, — это фрагменты ДНК, синтезированные в процессе амплификации со специфическим для каждого возбудителя инфекций праймером. Предложенный метод позволяет с высокой точностью диагностировать инфекционные болезни животных. Он считается самым лучшим методом диагностики вирусов и бактерий. Разработаны наборы ПЦР для диагностики КЧС, диареи, инфекционного ринотрахеита, африканской чумы лошадей, болезни Ньюкасла, ящура, инфекционного бронхита кур и других инфекционных болезней.

44. Санитарная пищевая вирусология. Концентрация населения в больших городах, развитие промышленности и рост промышленных объектов приводят к нарастанию биологического загрязнения окружающей среды, сточных вод, открытых водоемов, почвы, а также в несколько меньшей степени подземных водоисточ-ников и атмосферного воздуха. Тем самым создаются условия для выживаемости и циркуляции вирусов в объектах окружающей среды. Поскольку сохранение жизнеспо-собности вируса в воде, почве, воздухе, пищевых продуктах является одним из основных факторов, способствующих распространению инфекций в восприимчивых коллективах, возникла необходимость изучения патогенных для человека вирусов в объектах внешней среды. Этим занимается санитарная вирусология.

Предметом санитарной вирусологии является изучение поведения различных патогенных для человека вирусов в объектах окружающей среды (вода, почва, воздух, пищевые продукты и др.), разработка методов их индикации и эффективных мероприятий по санации объектов окружающей среды.

Задачей санитарно-вирусологической службы является систематическое санитарно-вирусологическое обследование сточных вод на городских очистных сооружениях, воды открытых водоемов, используемой для питьевого и хозяйственного водоснабжения, питьевой воды источников централизованного водоснабжения, почвы земледельческих полей орошения, воздуха больничных и поликлинических учреждений, продуктов питания и т. д. Эти исследования позволяют контролировать циркуляцию патогенных для человека вирусов в окружающей среде.

Индикация вирусов в окружающей среде состоит из нескольких этапов: 1) концентрация вирусных агентов из окружающей среды; 2) транспортировка проб в лабораторию; 3) выделение вирусов в культурах клеток, на лабораторных животных или куриных эмбрионах; 4) идентификация выделенных агентов. Транспортировка, выделение вирусов и их идентификация осуществляются с помощью общепринятых вирусологических методов, и специфической для санитарной вирусологии проблемой является лишь концентрация вирусов из окружающей среды, потребовавшая разработки специальных методических приемов.

Основной причиной наличия в воде патогенных для человека вирусов является загрязнение ее фекалиями человека.

В фекалиях человека обнаруживаются более 100 различных вирусов, некоторые из них, принадлежащие к семейству пикорнавирусов, аденовирусов и реовирусов, об-ладают термостабильностью и долгое время могут сохранять жизнеспособность, многие из них устойчивы к обычным дезинфектантам, включая хлорирование, и могут быть обнаружены в сточных водах на далеком расстоянии от источника контаминации.

В воде при контаминации ее человеческими фекалиями обнаруживаются те же вирусы, что в фекалиях.

Воздушно-капельный путь передачи инфекции характерен для инфекций дыхательных путей — наиболее массовых инфекционных заболеваний. Вирусы попадают в воздух в виде капельной фазы аэрозоля в результате чиханья, кашля, разговора и находятся в составе капель различной величины, состоящих из слюны, слизи и солей. В наиболее высоких концентрациях вирус содержится в крупных каплях, которые мало устойчивы в аэрозоле и быстро оседают. Более длительное время во взвешенном состоянии находятся мелкие капли вирусного аэрозоля. Высыхание капель аэрозоля сопровождается инактивацией вируса.

Заражение респираторными вирусами в основном осуществляется за счет капельной фазы аэрозоля в закрытых помещениях. В первую очередь заражаются восприимчивые люди, находящиеся в непосредственной близости от больного. Менее опасно вдыхание высохших капель, в которых часть вирусных частиц уже инактивирована. Концентрация частиц в аэрозольном облаке уменьшается за счет разведения большими объемами воздуха и оседания крупных капель аэрозоля. Вместе с тем наличие в аэрозоле мелких капель дает возможность вирусу проникать в нижние отделы дыхательных путей. Инфекционный агент может переноситься токами воздуха на значительные расстояния — десятки километров от очага инфекции. Распространение вирусов зависит от скорости ветра; напротив, дождливая погода ограничивает распространение вирусов.

Устойчивые во внешней среде вирусы, в первую очередь аденовирусы, могут с пылевой фазой аэрозоля многократно поступать в воздух и длительно циркулировать в данном помещении.

По устойчивости вирусов в аэрозоле и на поверхностях их можно разделить на две группы: малоустойчивые вирусы, такие как парамиксовирусы (вирусы парагриппа и особенно респираторно-синцитиальный вирус) и несколько более устойчивые вирусы гриппа, которые пере-даются от больных людей здоровым только в виде капельной фазы аэрозоля, и устойчивые вирусы, такие как аденовирусы и ECHO вирусы, которые проникают в организм не только в виде капельной фазы, но и пылевой фазы аэрозоля.

Сан-пищ.вирусология. Исследование пищевых продуктов производят по эпидпоказаниям. Вирусы, находящиеся в жидких молочных продуктах, концентрируют с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 или 6000 или с помощью цитрата натрия с последующей экстракцией фреоном 113.

Обработка полутвердых пищевых продуктов (творог, творожные продукты, мясные и рыбные полуфабрикаты, хлеб) и твердых (крупа, сыры, мясо и др.) заключается в экстрткции вирусных частиц в жидкую фазу, из экстракта вирус осаждают с помощью полиэтиленгликоля.

Контаминация вирусами овощей возможна при использовании инфицированных сточных вод на полях орошения, огородах и приусадебных участках. Для десорбции вирусных частиц с поверхности овощей их зали-вают фосфатным буфером (pH 8,2), взбалтывают, жидкость осветляют центрифугированием и вирус из надоса- дочной жидкости концентрируют, как указано выше.

45. Индикация вирусов в окружающей  среде. Выделение респираторных вирусов из воздуха закрытых помещений является одним из наиболее важных и в то же время сложных вопросов санитарной микробиологии. Трудности объясняются, с одной стороны, как правило, небольшими концентрациями инфекционного агента в воздухе помещений даже при наличии источника — больного, с другой — необходимостью исследования больших объемов воздуха за короткие промежутки времени. Обнаружение респираторных вирусов в воздухе требует применения специальных методических приемов. Вместе с тем индикация вирусов в воздухе закрытых помещений и в первую очередь в больничных помещениях является важным этапом санитарно-вирусологического контроля воздушной среды, так как наличие патогенной флоры является показателем эпидемической опасности воздушной среды в распространении инфекций дыхательных путей. Следует также иметь в виду, что биологическая активность респираторных вирусов по мере нахождения их в воздушной среде снижается. В связи с этим механизм улавливания вирусных аэрозолей должен характеризоваться щадящим действием в отношении улавливаемых биологических объектов, т. е. быть максимально препятствующим инактивации вируса. Как уже детально рассматривалось выше, на моделях различных вирусов в капельной фазе аэрозоля были отработаны методические приемы индикации вирусов применительно к высоким концентрациям, которые создаются в аэрозольной камере при диспергировании вируссодержащей суспензии. В специальных исследованиях, направленных на обнаружение минимальных концентраций вируса гриппа в воздухе аэрозольной камеры, были показаны как высокая эффективность улавливании прибором Речменского, так и возможность определения вируса при его небольших концентрациях в аэрозоле.

Санитарно – микробиологические показатели воздуха определяют седиментационным или аспирационным методами.

Аспирационный метод отбора проб — принудительное осаждение микробных частиц из воздуха. Для этого используют пробоотборник аэрозоля бактериологического. Принцип его действия основан на электризации частиц исследуемого воздуха и последующем их осаждении на электроде противоположного знака, роль которого играет металлический поддон с питательной средой. После инкубирования питательной среды подсчитывают количество выросших колоний и выражают обсемененность воздуха на определенный объем исследованного воздуха.

Седиментационный метод — осаждение микробов на поверхность плотной питательной среды под действием силы тяжести (гравитации). Открытую чашку Петри с питательной средой ставят на горизонтальную поверхность и оставляют на определенное время. Затем чашку закрывают и инкубируют в термостате. С помощью этого метода можно ориентировочно определить микробную обсемененность воздуха.

1. Общее  количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха (обсемененность воздуха) — количество колоний микроорганизмов, выросших при посеве воздуха на питательном агаре в чашке Петри в течение 24 ч при 37С.

2. Индекс  санитарно-показательных микробов—  количество золотистого стафилококка  и гемолитических стрептококков в 1 м3 воздуха. Эти бактерии являются представителями микрофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроорганизмами, передающимися воздушно-капельным путем. Появление в воздухе спорообразующих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель возможного антисанитарного состояния.

Пример: выделение вируса оспы из воздуха больничной палаты

46. Санитарная вирусология воды. САНИТАРНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ ВОДЫ

Основной причиной наличия в воде патогенных для человека вирусов является загрязнение ее фекалиями человека.

В фекалиях человека обнаруживаются более 100 различных вирусов, некоторые из них, принадлежащие к семейству пикорнавирусов, аденовирусов и реовирусов, об-ладают термостабильностью и долгое время могут сохранять жизнеспособность, многие из них устойчивы к обычным дезинфектантам, включая хлорирование, и могут быть обнаружены в сточных водах на далеком расстоянии от источника контаминации.

В воде при контаминации ее человеческими фекалиями обнаруживаются те же вирусы, что в фекалиях (табл. 20).

Наибольшее выделение кишечных вирусов происходит летом и осенью в связи с увеличением количества кишечных заболеваний. Однако вспышки гастроэнтеритов, вызванных ротавирусами, встречаются обычно зимой и ранней весной. Массивное выделение энтеровирусов из кишечника больных людей и здоровых вирусоносителей вызывает значительное обсеменение вирусами сточных вод, а устойчивость их к неблагоприятным факторам внешней среды обусловливает длительное выживание в воде. Таким образом, сточные воды являются основным резервуаром энтеровирусов во внешней среде.

Длительность сохранения вирусов в воде. Вирусы обнаруживаются в концентрации 1 млн. на 1 г. Время пе-реживания некоторых вирусов в воде достигает нескольких месяцев.

Длительность сохранения в воде вирусов значительно повышается при понижении температуры. Так, вирус полиомиелита выживает в речной и водопроводной воде при температуре 4° С 90 дней, а при температуре 37 и 20° С соответственно 10 и около 40 дней. Чем выше исходная концентрация вируса, тем более длительное время он обнаруживается в воде. Сроки выживания колеблются для разных вирусов. Наиболее длительно в воде выживают вирусы Коксаки группы А, менее длительно — вирусы полиомиелита, наиболее короткие сроки выживаемости — для вирусов Коксаки группы В (30—50 дней). Вирусы ECHO 7 более длительно выживают в воде, чем вирусы полиомиелита. Аденовирусы более устойчивы, чем вирусы полиомиелита и ECHO. Аденовирусы некоторых серотипов сохраняли свою активность в воде при температуре 4° С в течение 2 лет и более. К неблагоприятным факторам внешней среды наиболее устойчив из группы энтеровирусов вирус гепатита А. Вирус способен к длительному выживанию в воде в течение нескольких недель и даже месяцев. Известны водные вспышки гепатита А, например, распространение инфекции через сырую колодезную воду. Выживаемость вирусов более продолжительна в загрязненных водах. В морской воде сроки выживаемости более короткие в связи с повышенным содержанием солей и наличием йода, обладающего вирулицид- ным действием. Возможное вирулицидное действие оказывают находящиеся в морской воде микроорганизмы и растворенные химические вещества.