- Экспресс методы диагностики вир. болезней.
Экспресс-методы позволяют в короткие
сроки обнаружить в патологическом материале
вирусы в неактивной форме, а именно вирусные
антигены, тельца-включения и элементарные
тельца. Для обнаружения вирусных антигенов
в патологическом материале используют
наиболее чувствительные методы, так как
их концентрация в нем обычно низкая. Наибольшее
распространение получила реакция иммунофлуоресценции
(РИФ). Для этого на мазки-отпечатки или
срезы из патматериала наносят меченные
флуорохромами гипериммунные сыворотки,
при этом образуются светящиеся иммунные
комплексы. Препараты просматривают с
помощью люминесцентного микроскопа.
Этот метод флуоресцирующих антител отличается
быстротой и очень высокой чувствительностью.
Однако его результаты требуют подтверждения
другими методами из-за возможного неспецифического
свечения. Вирусные гемагглютинины в патматериале
обнаруживают с помощью реакции гемагглютинации
(РГА). Гемагглютинин — это белок, расположенный
в оболочке вируса. Явление гемагглютинации
обусловлено склеиванием эритроцитов
крови с помощью вируса. Механизм его состоит
в том, что одна вирусная частица с помощью
своего гемагглютинина адсорбируется
одновременно на двух эритроцитах, образуя
«мостик» между ними, в результате чего
эритроциты склеиваются между собой и
выпадают в осадок в виде раскрытого зонтика.
Тельца-включения и элементарные тельца
вирусов указывают на присутствие вирусов
в патологическом материале. Тельца-включения
— это внутриклеточные элементы, образующиеся
в клетках как результат репродукции в
них некоторых вирусов (около 100 ви русов).
Как правило, РНК-вирусы образуют цитоплазматические
включения, ДНК-вирусы — внутриядерные.
Тельца-включения, образуемые вирусом
осповакцины, называют тельцами Гварние-ри,
оспы овец — Борреля, оспы кур — Боллингера,
чумы плотоядных — Лейтца, инфекционного
ларинготрахеита кур — Зейфреда. Наиболее
известны и имеют практическое значение
тельца Бабе-ша—Негри, образуемые вирусом
бешенства в цитоплазме нервных клеток:
на их обнаружении основан один из методов
лабораторной диагностики бешенства.
Для этого из определенных отделов головного
мозга (аммоновы рога, мозжечок, продолговатый
мозг) подозреваемого на заболевание бешенством
животного приготовляют гистологические
срезы или препараты-мазки. Срезы окрашивают
по Муромцеву (Туревичу, Селлерсу и др.),
препараты-мазки обрабатывают меченной
флуорохромом иммунной сывороткой. Гистосрезы
просматривают под световым микроскопом,
препараты-мазки — под люминесцентным
микроскопом. Если в серии препаратов
будут обнаружены тельца Бабеша—Негри,
то наличие вируса бешенства считается
доказанным. Обнаружение телец-включений
при других вирусных болезнях имеет лишь
вспомогательное диагностическое значение.
Крупные вирусы, названные в свое время
элементарными тельцами, в патологическом
материале обнаруживают под обычным световым
микроскопом после их обработки солями
тяжелых металлов (например, элементарные
тельца при оспе).
- Ретроспективный метод диагностики вир.болезней.
Для диагностики вирусных болезней животных
и людей широко используют различные серологические
реакции. Они основаны на взаимодействии
вирусных антигенов со специфическими
(гомологичными, своими) антителами. Вирусы
являются антигенами, так как их белковая
оболочка вызывает выработку специфических
антител. Антитела накапливаются в основном
в сыворотке крови. Они способны соединяться
в комплекс антиген + антитело только со
своим антигеном. Если антиген — инфекционный
агент (вирус), антитела его нейтрализуют:
в этом состоит биологическая роль антител.
Взаимодействие антител со своими антигенами
возможно не только в живом организме,
но и в пробирке. На этом и основаны серологические
реакции (от лат. serum — сыворотка). Если
взятая пара АГ (антиген) и AT (антитело)
гомологичны или соответствуют друг другу,
то в пробирке они образуют комплекс АГ+АТ.
Это позволяет обнаружить по известному
антителу неизвестный антиген. А если
брать сыворотку в разведениях, то можно
установить и титр антител в ней. Идентификация
неизвестного антигена возможна также
путем испытания его с различными антителами.
Обычно источником антител служит сыворотка
крови животных и людей, иммунизированных
искусственным или естественным путем
определенными вирусными антигенами.
Ати-генностью у вирусов обладают их белки.
Поэтому в серологических реакциях в качестве
вирусного антигена используют корпускулярный
антиген в виде суспензии вирусов или
растворимые белки вирусов. Широкое распространение
нашли следующие серологические реакции:
1) нейтрализации (РН); 2) торможения гемагглютинации
(РТГА); 3) непрямой гемагглютинации (РИГА);
4) связывания комплемента (РСК); 5) диффузной
преципитации (РДП); 6) торможения гемадсорбции
(РТГАд); 7) иммунофлуоресценции (РИФ). Все
эти реакции различаются между собой методом
определения образовавшегося комплекса
антиген + антитело или тем, что комплекс
вообще не образовался. При серологической
(ретроспективной) диагностике исследованиям
подлежат сыворотки больных животных
и людей. Обычно используют парные сыворотки,
для получения которых от каждого животного
(человека) кровь берут дважды с интервалом
в 2...3 нед: в начале, т. е. в острой стадии,
и в конце болезни, т. е. в период реконвалесценции.
Сроки взятия крови варьируют в зависимости
от особенностей течения болезни. Взятие
крови и получение из нее сыворотки осуществляют
в асептических условиях, так как сыворотки
должны быть стерильными. До исследования
сыворотки хранят в пробирках под пробками
в холодильнике или в замороженном состоянии.
Цель исследования — установить в парных
сыворотках наличие и титр антител к вирусам,
которые предположительно могли быть
возбудителями болезней у животных (человека),
от которых получены сыворотки. Основанием
для предположения, к каким вирусам искать
антитела, служит предварительный диагноз,
поставленный по данным эпизоотологических
наблюдений, клиническим признакам и па-толого-анатомическим
изменениям (в случае зооантропоноза —
по данным медслужбы). Наличие в сыворотках
антител и их титры определяют в серологических
реакциях; в качестве антигена используют
предполагаемый вирус. Выбор серологических
реакций определяется тем, какая реакция
наиболее результативна для данного вируса,
а также возможностями лаборатории и степенью
квалификации персонала. При этом также
учитывают быстроту получения ответа
и трудоемкость работы. После установления
титра антител в парных сыворотках прослеживают
динамику титра: нарастание титра антител
во второй сыворотке по сравнению с таковым
в первой в 4 раза и более достоверно свидетельствует
об активном инфекционном процессе в организме
животного (человека) в период взятия у
него крови. При этом болезнь была вызвана
тем вирусом, к которому определены антитела
в парных сыворотках. Недостаток серологической
диагностики заключается в ретро-спективности,
так как к моменту постановки диагноза
животное (человек), от которого получены
парные сыворотки, уже или выздоровело,
или пало. Однако серологические методы
позволяют получить точный диагноз, что
служит обоснованием мероприятий по ликвидации
вспышки вирусной болезни или ее эпизоотии.
Как известно, в сыворотках крови животных
(человека) содержатся не только специфические
противовирусные антитела, но и так называемые
неспецифические ингибиторы. Как и антитела,
они относятся к гуморальным факторам
иммунитета и также нейтрализуют инфекционную
и гемагглютинирующую активность вирусов;
свое действие на вирусы они проявляют
не только в организме, но и ин витро. В
серологических реакциях используют сыворотки
крови, содержащие определенные антитела.
В этой же сыворотке находятся и неспецифические
ингибиторы, которые на вирусный антиген
оказывают совместное действие с антителами,
что ведет к искажению результатов. Поэтому
все сыворотки, предназначенные для серологических
реакций, обязательно предварительно
освобождают от неспецифических ингибиторов
вирусов. Химическая структура ингибиторов
различна, поэтому и методы освобождения
от них сывороток крови разные. Различают
две группы ингибиторов: термолабильные
и термостабильные. Термолабильные ингибиторы
разрушаются при прогревании сыворотки
крови в течение 30 мин при 56...63 °С. Обычно
перед прогреванием сыворотки разводят
физиологическим раствором не менее чем
в 2 раза, чтобы они не свернулись. Одни
термостабильные ингибиторы выдерживают
нагревание до 75, другие до 100 С. От них
сыворотки очищают путем обработки химическими
реактивами или хорошо адсорбирующими
веществами. Из химических реагентов наиболее
часто используют диоксид углерода (СО2),
периодат калия (КЮ4), фильтрат холерного
вибриона, риванол, зимозан и др., а из адсорбентов
— каолин [природное соединение, силикат,
составляющий основу различных глин, содержит
большое количество алюминия и кремнезема
(песок), химическая формула — А12О3 • 2SiO2
• 2Н2О; порошок серовато-белого цвета],
бентонит, активированный уголь. Метод
удаления термолабильных ингибиторов
выбирают в зависимости от вида животного,
от которого получена сыворотка, и от вируса,
антитела к которому будут использованы.
Далее рассмотрим принципы постановки
отдельных серологических реакций. Реакция
нейтрализации (РН). Наиболее универсальная
реакция и широко применяется в вирусологии.
Принцип РН состоит в следующем: в пробирке
смешивают в равных объемах вирусный антиген
и исследуемую сыворотку, смесь выдерживают
при определенной температуре и определенное
время (4, 22, 37 °С от 30 мин до 18 ч) в зависимости
от вида вирусов. Затем этой смесью заражают
восприимчивые живые биологические системы
(культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные
животные). Если в исследуемой сыворотке
находятся антитела, соответствующие
(гомологичные) взятому вирусу, то они
нейтрализуют вирус и биологическая проба
окажется отрицательной, что будет свидетельствовать
об образовании комплекса антиген+антитело.
Результаты РН вируса устанавливают по
отсутствию: 1) цитопа-тического действия
или бляшкообразования в культуре клеток;
2) гибели, патологических изменений в
оболочках и гемагглютини-нов в жидкостях
полостей у куриных эмбрионов; 3) гибели,
развития клинической картины и патологических
изменений в органах и тканях у лабораторных
животных. Реакцию нейтрализации можно
ставить в двух модификациях: 1) обнаружение
и титрование неизвестных противовирусных
антител в разных разведениях исследуемой
сыворотки (последовательные двукратные),
используя постоянную дозу известного
вируса; 2) идентификация неизвестного
выделенного вируса по индексу нейтрализации,
используя постоянные разведения известной
гипериммунной сыворотки и разные дозы
вируса (вируссодержащего материала в
виде последовательных 10-кратных разведений).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).
Принцип РТГА состоит в том, что при контакте
вируса с гомологичными антителами происходит
связывание антител с гемагглютининами
вируса, в результате чего вирус теряет
свойство агглютинировать.
21. Серологические реакции в
вирусологии. Для диагностики вирусных
болезней животных и людей широко используют
различные серологические реакции. Они
основаны на взаимодействии вирусных
антигенов со специфическими (гомологичными,
своими) антителами.
Вирусы являются
антигенами, так как их белковая оболочка
вызывает выработку специфических антител.
Антитела накапливаются в основном в сыворотке
крови. Они способны соединяться в комплекс
антиген + антитело только со своим антигеном.
Если антиген — инфекционный агент (вирус),
антитела его нейтрализуют: в этом состоит
биологическая роль антител.
Взаимодействие
антител со своими антигенами возможно
не только в живом организме, но и в пробирке.
На этом и основаны серологические реакции
(от лат. serum — сыворотка). Если взятая пара
АГ (антиген) и AT (антитело) гомологичны
или соответствуют друг другу, то в пробирке
они образуют комплекс АГ+АТ. Это позволяет
обнаружить по известному антителу неизвестный
антиген. А если брать сыворотку в разведениях,
то можно установить и титр антител в ней.
Идентификация неизвестного антигена
возможна также путем испытания его с
различными антителами.
Обычно источником
антител служит сыворотка крови животных
и людей, иммунизированных искусственным
или естественным путем определенными
вирусными антигенами. Ати-генностью у
вирусов обладают их белки. Поэтому в серологических
реакциях в качестве вирусного антигена
используют корпускулярный антиген в
виде суспензии вирусов или растворимые
белки вирусов.
Широкое распространение
нашли следующие серологические реакции:
1) нейтрализации (РН); 2) торможения гемагглютинации
(РТГА); 3) непрямой гемагглютинации (РНГА);
4) связывания комплемента (РСК); 5) диффузной
преципитации (РДП); 6) торможения гемадсорбции
(РТГАд); 7) иммунофлуоресценции (РИФ). Все
эти реакции различаются между собой методом
определения образовавшегося комплекса
антиген + антитело или тем, что комплекс
вообще не образовался.
При серологической
(ретроспективной) диагностике исследованиям
подлежат сыворотки больных животных
и людей. Обычно используют парные сыворотки,
для получения которых от каждого животного
(человека) кровь берут дважды с интервалом
в 2...3 нед: в начале, т. е. в острой стадии,
и в конце болезни, т. е. в период реконвалесценции.
Сроки взятия крови варьируют в зависимости
от особенностей течения болезни. Взятие
крови и получение из нее сыворотки осуществляют
в асептических условиях, так как сыворотки
должны быть стерильными. До исследования
сыворотки хранят в пробирках под пробками
в холодильнике или в замороженном состоянии.
Цель исследования — установить в парных
сыворотках наличие и титр антител к вирусам,
которые предположительно могли быть
возбудителями болезней у животных (человека),
от которых получены сыворотки.
Основанием
для предположения, к каким вирусам искать
антитела, служит предварительный диагноз,
поставленный по данным эпизоотологических
наблюдений, клиническим признакам и па-толого-анатомическим
изменениям (в случае зооантропоноза—
по данным медслужбы). Наличие в сыворотках
антител и их титры определяют в серологических
реакциях; в качестве антигена используют
предполагаемый вирус. Выбор серологических
реакций определяется тем, какая реакция
наиболее результативна для данного вируса,
а также возможностями лаборатории и степенью
квалификации персонала. При этом также
учитывают быстроту получения ответа
и трудоемкость работы.После установления
титра антител в парных сыворотках прослеживают
динамику титра: нарастание титра антител
во второй сыворотке по сравнению с таковым
в первой в 4 раза и более достоверно свидетельствует
об активном инфекционном процессе в организме
животного (человека) в период взятия у
него крови. При этом болезнь была вызвана
тем вирусом, к которому определены антитела
в парных сыворотках.
Недостаток
серологической диагностики заключается
в ретроспективное™, так как к моменту
постановки диагноза животное (человек),
от которого получены парные сыворотки,
уже или выздоровело, или пало. Однако
серологические методы позволяют получить
точный диагноз, что служит обоснованием
мероприятий по ликвидации вспышки вирусной
болезни или ее эпизоотии.
Как известно,
в сыворотках крови животных (человека)
содержатся не только специфические противовирусные
антитела, но и так называемые неспецифические
ингибиторы. Как и антитела, они относятся
к гуморальным факторам иммунитета и также
нейтрализуют инфекционную и гемагглютинирующую
активность вирусов; свое действие на
вирусы они проявляют не только в организме,
но и ин витро. В серологических реакциях
используют сыворотки крови, содержащие
определенные антитела. В этой же сыворотке
находятся и неспецифические ингибиторы,
которые на вирусный антиген оказывают
совместное действие с антителами, что
ведет к искажению результатов. Поэтому
все сыворотки, предназначенные для серологических
реакций, обязательно предварительно
освобождают от неспецифических ингибиторов
вирусов.
Химическая
структура ингибиторов различна, поэтому
и методы освобождения от них сывороток
крови разные. Различают две группы ингибиторов:
термолабильные и термостабильные. Термолабильные
ингибиторы разрушаются при прогревании
сыворотки крови в течение 30 мин при 56...63
°С. Обычно перед прогреванием сыворотки
разводят физиологическим раствором
не менее чем
в 2 раза, чтобы они не свернулись. Одни
термостабильные ингибиторы выдерживают
нагревание до 75, другие до 100 "С. От них
сыворотки очищают путем обработки химическими
реактивами или хорошо адсорбирующими
веществами. Из химических реагентов наиболее
часто используют диоксид углерода (СО2),
периодат калия (КЮ4), фильтрат холерного
вибриона, риванол, зимозан и др., а из адсорбентов
— каолин [природное соединение, силикат,
составляющий основу различных глин, содержит
большое количество алюминия и кремнезема
(песок), химическая формула — А12О3 • 2SiO2
• 2Н2О; порошок серовато-белого цвета],
бентонит, активированный уголь.
Метод удаления
термолабильных ингибиторов выбирают
в зависимости от вида животного, от которого
получена сыворотка, и от вируса, антитела
к которому будут использованы.
- Живые вирусные вакцины. Живые вирусные
вакцины — это, как правило, искусственно
ослабленные посредством культивирования
или природные авирулентные либо слабовирулентные
иммуногенные штаммы вируса, которые,
размножаясь в естественно восприимчивом
организме, не проявляют повышения вирулентности
и потеряли способность к горизонтальной
передаче. Живые вакцины изготовляют из
живых ослабленных штаммов вирусов. Такие
штаммы должны обладать следующими свойствами:
утрата вирулентности исходного вируса;
сохранение способности приживаться и
размножаться в организме; сохранение
специфической иммуногенности исходного
патогенного штамма и способность вызывать
образование иммунитета у привитых животных.
Вакцинные штаммы должны вызывать т.н.
вакцинальный процесс. Получение вакцинных
штаммов с перечисленными свойствами
удается путем культивирования вирулентных
вирусов в условиях, не соответствующих
их природным потребностям адаптирования
к маловосприимчивым или не восприимчивым
животным, а так же выращивание в развивающихся
куриных эмбрионах или культуре клеток.
Для приготовления живых вакцин используют
так же гетеротипичные антигенно-родственные
апатогенные штаммы. Технология изготовления
живых вакцин сводится к культивированию
вакционного штамма вируса в какой-либо
биологической живой системе. Полученный
вируссодержащий материал подвергают
очистке от балластных веществ. Далее
проводят контроль на чистоту, безвредность
и активность на восприимчивых животных.
Живые вакцины не содержать консервантов,
поэтому при вскрытии ампул и растворении
их содержимого необходимо строго соблюдать
правила асептики. При накожном методе
вакцинации необходимо использование
для предварительной обработке таких
дезинфицирующих средств, которые длительное
время сохраняются на месте применения
препарата.
- Инактивированные вирусные вакцины.
Изготовление инактивированных вакцин
т.ж. начинается с культивирования и накопления
производственного штамма вируса в чувствительной
биологич. живой с-ме (ж-ые, эмбрионы, культуры
кл-к и тканей). Полученный вируссодержащий
материал гомогенезируют и подвергают
очистке. Очистка при получении инактивированных
вакцин является важным этапом, т.к убитый
вирус не репродуцируется в организме
и для получения достаточно интенсивного
иммунного ответа необходимо вводить
при вакцинации значительное кол-во вируссодержащего
мат-ла. Суспензия вируса используемая
для изготовления вакцин, обычно содержит
значительные количества компонентов
кл-к, к-ые оказывают дополнительную нагрузку
на иммунную систему орг-ма. Поэтому вирусные
суспензии должны быть очищены от балластных
агентов; обычно используют низкоскоростное
центрифугирование. Далее основное требование,
предъявляемое к убитым вакцинам, - полная
и необходимая инактивация генома при
максимальной сохранности антигенной
детерминанты и иммунная защита жив-ых.
Поэтому инактивант должен необратимо
повреждать нуклеиновую кислоту и в минимальной
степени затрагивать белки. При абсолютной
инактивации вируса должны быть такие
изменения генома, которые исключают транскрипцию
или трансляцию вирусной РНК или репликацию
вирусной нуклеиновой кислоты. Для получения
инактивированных вакцин в качестве инактиванта
широко используют формалин, гидроксиламин,
этанол, этиленимин, воздействие температуры
и др.инактивирующие инфекционность факторы.
Все реагенты, к-ые исп-ют для инактивации
вирусов должны активно реагировать с
компонентами нуклеиновых кислот, т.е.
являться сильными мутагенами. Поэтому
избыток инактиванта по окончании реакции
должен быть полностью удален или переведен
в неактивную форму. Для повышения иммуногенной
активности к инактивированной вирусной
суспензии (вакцине) доб-ют адъюванты:
гидроокись алюминия, сапонин, минеральное
масло и др. Для консервации вакцины используют
глицерин, фенол, мертиалят. На конечном
этапе перед выпуском вакцину проверяют
на наличие остаточной вирулентности
(на восприимч. и лаб. животных, в культуре
клеток), на стерильность, на иммунногенную
активность. Вакцины, не прошедшие контроль
по одному из указанных тестов бракуют.