Шпаргалка по «Вирусологии»

24. Генно-инженерные вакцины. Рекомбинантные вакцины получают с помощью биотехнологии. Их изготовление – новое направление в создании генно-инженерных противовирусных вакцин, суть которого состоит во введении в геном крупных вирусов генов протективных белков (противорусных). В качестве продуцента протективного антигена вируса наиболее часто используют кишечную палочку. В плазмиду кишечной палочки встраивают ген вируса, ответственный за синтез протективного антигена. Полученную кишечную палочку культивируют в реакторах, которые синтезируют полипептид вируса. Из бактериальной культуры полипептид вируса выделяют методом молекулярной биологии. Для начала получают ген, который должен быть встроен в геном реципиента. Небольшие гены могут быть получены методом химического синтеза. Для этого расшифровывается число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, затем по этим данным узнают очерёдность нуклеотидов в гене, далее следует синтез гена химическим путем.

Крупные структуры, которые довольно сложно синтезировать получаются путем выделения (клонирования), прицельного выщепления этих генетических образований с помощью рестриктаз.

Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов сшивается с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека и животных. Экспрессируемый ген встраивается в бактериальную или животную клетку, которая начинает синтезировать несвойственное ей ранее вещество, кодируемое экспрессируемым геном.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используется E. coli, B. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы, некоторые штаммы способны переключаться на синтез чужеродного вещества до 50% своих синтетических возможностей – эти штамм называются суперпродуцентами.

Иногда к генно-инженерным вакцинам добавляется адъювант.

25. Диагностикумы – иммунные сыворотки и антигены. Основные св-ва м/орг-ов. ^ Общими свойствами микроорганизмов являются:

-малые размеры (размеры микроорганизмов измеряются в мкм, 1 мкм = 1-6 м);

-Высокая скорость обменных процессов. Это связано с большим отношением поверхности обмена к объему клетки. Для микроорганизмов вся поверхность клетки является поверхностью обмена. Так как клетки бактерий самые мелкие, то они растут и развиваются быстрее всех микроорганизмов, за ними следуют дрожжи и грибы. В свою очередь, скорость обменных процессов у микроорганизмов в десятки и сотни тысяч раз выше, чем у животных. Например, в организме одного быка весом в 500 кг за 24 часа образуется примерно 0,5 кг белка; за это же время 500 кг дрожжей могут синтезировать более 50 000 кг белка;

-широкое распространение в природе. Малые размеры микроорганизмов имеют значение для экологии. Микроорганизмы могут распространяться с воздушными потоками и существуют повсюду;

-пластичность обмена – высокая способность к адаптации (приспособлению к новым условиям существования). Несравненно большая гибкость обменных процессов у микроорганизмов по сравнению с растениями и животными объясняется их способностью синтезировать индуцибельные ферменты, т.е. ферменты, которые образуются в клетке только при наличии в среде соответствующих веществ;

-высокая степень изменчивости. Более высокая степень изменчивости микроорганизмов по сравнению с макроорганизмами связана с тем, что большинство микроорганизмов являются одноклеточными организмами. На отдельную клетку воздействовать легче, чем на организм, состоящий из множества клеток. Высокая степень изменчивости, быстрый рост и развитие, высокая скорость обменных процессов, образование многочисленного потомства – все эти свойства микроорганизмов делают их чрезвычайно удобными объектами для генетического анализа, так как опыты можно проводить в короткие сроки на огромном числе особей.

Применение иммунных сывороток. Применяемые с лечебной целью специфические антитела выпускаются промышленностью в виде иммунных сывороток или активных в иммунном отношении фракций - иммуноглобулинов. Их готовят из крови людей (гомологичные) или животных (гетерологичные). Гомологичные иммунные препараты обладают определенным преимуществом перед гетерологичными в связи со сравнительно большой продолжительностью (до 1-2 мес.) их циркуляции в организме и отсутствием у них побочных эффектов. Сыворотки и иммуноглобулины, изготовленные из крови животных, действуют сравнительно недолго (1-2 нед.) и способны вызывать побочные реакции. Их можно применять только после проверки чувствительности организма больного с помощью внутрикожной пробы с разведенными препаратами. Сыворотку назначают при отрицательной пробе после предварительной десенсибилизации организма, осуществляемой путем последовательного подкожного (с интервалом в 30-60 мин) введения небольших порций этого вещества. Затем внутримышечно применяется вся доза лечебной сыворотки.

Изготовление и применение. В технологии изготовления иммунных сывороток можно выделить следующие основные этапы:

1)подбор  продуцентов: лошади, КРС, реже свиньи, овцы и кролики.

2)карантирование  продуцентов.

3)вакцинация; создание грунд-иммунитета. Подготовка  ж-х к гипериммунизации осущ-ся путем  введения соответств-ей вакцины. У ж-х выраб-ся АТ, кол-во к-х достаточно для защиты самого продуцента от возбудителя.

4)гипериммунизация (сверхвакцинация); Заключ-ся в многократных  парентеральных(подкожных, внутримышечных, внутривенных) введениях нарастающих дох соответствующего возбудителя (АГ) ч-з определенные промежутки времени.

5)эксплуатация. От продуцентов 2-4 раза в месяц  из вены берут кровь с целью  получения иммунной сыворотки. Первое  взятие крови обычно проводят  ч-з 7-10 суток после последнего взятия АГ с целью активизации синтеза АТ. У ж-х берут кровь около 15 мг/кг.

6)обработка  крови и получение сыворотки. Взятую от продуцента кровь  выдерживают 3 часа при температуре 37оС, затем отстаивают 24-48 ч, при 8оС, после чего производят слив сыворотки. Полученную сыворотку консервируют и выдерживают не менее 20 сут при 37оС. Далее осуществляют контроль на стерильность, безвредность, специфическую активность.

Гипериммунные сыворотки применяют для лечебных и профилактических целей, так как они создают лишь временный пассивный иммунитет. Иммунитет наступает в ближайшие часы после введения сыворотки (2...3 ч) и не превышает 2...3 нед.

В ветеринарии применяют следующие сыворотки: поливалентная антитоксическая сыворотка против паратифа телят, ягнят, овец и птиц; поливалентная антитоксическая сыворотка против колибактериоза телят, поросят, ягнят; гипериммунная сыворотка про­тив пастереллеза крупного рогатого скота, буйволов, овец и свиней; сыворотка против рожи свиней; антитоксическая сыворотка против анаэробной дизентерии ягнят и инфекционной энтеротоксемии овец; сыворотка против диплококковой септицемии телят, ягнят, поросят; антитоксическая противостолбнячная сыворотка.

Приготовление АГ на примере ящура. Приготовление антигена вируса ящура.

Стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физиологическим раствором рН 7,4—7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стерильным битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, к которой добавляют двойное по отношению к массе афт количество физиологического раствора (Dii 7,4—7,6), т. е. на 1г афт —2 мл раствора. Полученную 33% суспензию экстрагируют при комнатной температуре 2 ч, промц раживают при минус 10 — 20 "С в течение 5 — 18 ч. После размораживания центрифугируют 15—30 мин при 3000—5000 мин-1. Надосадочную жидкость инактивируют при 58 °С 40 мин. После инактивации, если в жидкости остаются хлопья, ее центрифугируй повторно 10—15 мин при 3000 мин-1 и затем используют в качестве антигена в РСК.

26. Лечение и химиотерапия вирусных  болезней. При вирусных болезнях применяют специфические биопрепараты – иммунные сыворотки и глобулины, иммунолактон,кровь или сыворотку реконвалесцентов, интерферон. Действие этих препаратов начинается после введения и продолжается до 2-3 недель.

Специфические глобулины представляют собой 10%-ый водный р-р глобулиновой фракции белка, выделенной из соответств-ей иммунной сыворотке. Глобулины выделяют из иммунных сывороток спиртовым, риваноловым методом. Н-р из антирабической сыворотки получают антирабический гамма-глобулин.

Реконвалесцентами называют переболевших ж-х, в орг-ме к-х накапливаются вируснейтрализубщие АТ. Сыворотку получают непосредственно в хоз-ве от переболевших или вакцинированных ж-х ч-з 3-4 нед после переболевания или последней вакцинации.

Химиотерапия вир инфекций. Химиотерапия бактериальных, протозойных и грибных инфекций достигла колоссальных успехов, дав практике сотни эффективных препаратов. Химиотерапия вирусных инфекций имеет более чем скромные успехи, и в будущем не видится ее взлета. Это и понятно, т.к. метаболизм вирусов тесно связан с обменом в-в поражаемых ими клеток. Т.о., основной принцип химиотерапии инф-ых болезней – поиск и создание в-в, к-ые были бы эффективными в отношении вирусов, не повреждая клетку.

Природа создала универсальный противовирусный препарат – интерферон, представляющий собой белок, продуцируемый зараженными клетками или целым организмом. Он не действует на внеклеточный вирус, но подавляет его репродукцию, т.е. действует на агент опосредованно ч-з чувствительные клетки, в к-х не нарушен синтез клеточной РНК и клеточных белков. Интерферон не обладает видоспецифическим антивирусным действием. Использование интерферона для лечения вирусных инфекций ограничивается его способностью защищать только инфицированные клетки, поэтому его следует применять в начале болезни. В последние годы ученые обратили внимание на противовирусное действие нуклеаз – белковых ферментативных в-в, вызывающих быстрое расщепление нуклеиновых кислот, в рез-те которого последние быстро теряют свою активность и в конце концов разрушаются.

27. Правила работы с вируссодержащим  материалом. Вирусологические методы предназначены для обнаружения активных форм вируса путем его выделения на живых биологических системах — культурах клеток и тканей, развивающихся куриных эмбрионах и лабораторных животных. Для этого из патологического материала делают 10%-ю суспензию на стерильном физиологическом растворе (рН 7,2...7,4), затем освобождают ее от крупных частиц путем центрифугирования в течение 20...30 мин при оборотах 2000...3000 мин"1. Для подавления бактериальной микро- и микофлоры к суспензии добавляют смесь антибиотиков (обычно пенициллин и стрептомицин по 200... 1000 ЕД каждого на 1 мл жидкости и нистатин) или для очистки пропускают ее через бактериальные фильтры. Эффективность такой обработки суспензии контролируют с помощью посевов ее на специальные питательные среды (для аэробов и анаэробов). Полученной и обработанной таким образом суспензией заражают живые биологические системы и регистрируют появление у них признаков репродукции вируса, что служит показателем наличия вируса в пат-материале. Однако вирус не всегда проявляет свое действие в первом пассаже и иногда требуется провести 2...3 «слепых» пассажа, чтобы вирус адаптировался к биологической системе и накопился в достаточном количестве для проявления своего действия. Прежде всего заражают культуры клеток. Для этого в пробирки, флаконы или матрасы с выросшим монослоем клеток вносят небольшое количество суспензии для осуществления контактирования на 80...90 мин (для адсорбции и проникновения вируса в клетки), затем добавляют поддерживающую питательную среду, которая не обеспечивает дальнейшего размножения клеток; флаконы, пробирки и матрасы помещают в условия, благоприятные для инкубации. Происходит репродукция вируса в клетках. Пораженные вирусом клетки погибают, разрушаются, новое поколение вирусов выходит в культуральную жидкость, и происходит заражение новых клеток, из них — в следующие и так до тех пор, пока есть живые клетки. Обнаружение вируса в культуре клеток производят под малым увеличением светового микроскопа по цитопа-тическому действию (ЦПД) или эффекту (ЦПЭ). ЦПД — это любые изменения (дегенерация, гибель) клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Формы ЦПД разнообразны — от едва заметных изменений в цитоплазме до полного распада клеток на фрагменты. Обнаружение вируса, обладающего гемагглютинирующими свойствами, в культуре клеток возможно методом гемадсорбции. Гемадсорбция — это прилипание эритроцитов к поверхности клеток, зараженных гемагглютинирующим вирусом. Для наблюдения гемадсорбции необходимо из пробирки, флакона и т. д. с зараженной вирусом культурой клеток удалить культуральную жидкость и добавить 2...3 капли 2,5%-й суспензии эритроцитов. Пробирки, флаконы оставляют в горизонтальном положении в течение 10 мин, затем слой клеток споласкивают физраствором, чтобы смыть эритроциты. Если в зараженной культуре клеток происходит репродукция вируса, то на таких клетках под микроскопом видны адсорбировавшие эритроциты. Большое значение имеет другая биологическая система для выделения вирусов — живые куриные эмбрионы 5...13-суточ-ного возраста. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого зародыша, на хорион-аллантоисной оболочке, в стенках желточного мешка, накапливаясь в этих же структурах и в жидкостях аллантоисной и амниотической полостей. Признаками размножения вируса в куриных эмбрионах являются их гибель и па-толого-анатомические изменения на эмбриональных оболочках и структурах. Куриные эмбрионы чувствительны к большинству вирусов птиц и некоторым вирусам млекопитающих (грипп, оспа, чума и др.). В качестве биологической системы для выделения вирусов также используют лабораторных животных (белые мыши, белые крысы, хомячки, морские свинки, кролики, птицы и др.). Существует большое количество методов введения инфекционного материала. Выбор метода заражения зависит от тропизма вирусов и чувствительности животного. За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменения в их поведении, сроки появления специфических признаков болезни. Признаками репродукции вирусов в организме животных являются их гибель, клинические признаки болезни и патолого-анатомические изменения в бронхах и тканях. При отсутствии моделей лабораторных животных при некоторых вирусных болезнях для выделения вирусов используют естественно-восприимчивых животных.

28. Получение консервирование и  транспортировка пат.материала. Материал для исследований от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2-3 часов после клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или в первые 1-2 дня значительно ослабевает барьерная роль кишечника, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссеминации кишечной флоры. Кроме того, по мере продолжения и даже углубления инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма. При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения и пути выделения). При респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носа и глотки; при энтеровирусных – кал; при дермотропных – свежие поражения кожи. Материалов для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа. Кровь берут из яремной вены, у свиней – из кончика хвоста или уха. Смывы с конъюнктивы, со слизистой носа, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы. При взятии материала из носоглотки можно пользоваться прибором, сконструированным Томасом и Скотом. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Мочу собирают при помощи катетера в стерильную посуду. Фекалии берут из прямой кишки шпателем или палочкой и помещают в стерильную пробирку. Везикулярную жидкость можно собирать шприцем или пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом. После смерти животного важно как можно быстрее взять кусочки органов, т.к. при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус м\б вообще не обнаружен или его количество окажется очень малым. Далее патматериал помещают в низкие температуры (сухой лед+спирт; снег+соль) или глицерин на ИХН. Патматериал должен быть снабжен надежной и четкой этикеткой. Нужно написать какой материал и от какого животного получен. На термос с пробами ПМ навешивают бирку из картона или фанеры на которой указывают хозяйство, вид животного, вид материала, дату. Термос должен быть опечатан и доставлен нарочным. Доставленные в лабораторию пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают и измеряют. Часть берут на исследование, часть в холодильник. Подготовку органов и тканей проводят так: вирус высвобождают из клеток органов и тканей – материал тщательно измельчают и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Из растертого материала обычно готовят 10% суспензию на Хенксе или фосфатном буфере. Суспензию центрифугируют при 1500-3000 об\мин, надосадочную жидкость отсасывают и освобождают от микрофлоры обрабатывая антибиотиками (пенициллин, нистатин). Проводят экспозицию суспензии с АБ не менее 30-60 минут при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю путем посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро. Суспензию хранят при минус 20- минус 70 С.