Шпаргалка по «Вирусологии»

Из всех микроорганизмов в экспериментальных условиях наиболее длительной выживаемостью в воде различной степени загрязненности обладает фаг кишечной палочки (более 10 мес). Он является возможным кандидатом в санитарно-показательные микроорганизмы.

Методы концентрации кишечных вирусов, находящихся в воде. Исследованию подлежит вода централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов, плавательных бассейнов, сточные жидкости. Исследование сточных вод проводят с целью изучения циркуляции вирусов среди населения данной местности, степени инфицирования воды, эффективности работы очистных сооружений и т. п. Исследование воды поверхностных и подземных водоемов проводят при выборе источника для централизованного водоснабжения, для оценки санитарного состояния мест отдыха, по эпидемиологическим показаниям. Исследования питьевой воды проводят только по эпидемиологическим показаниям.

Методы концентрации вирусов из воды можно условно разделить на 4 группы.

Физические методы (ультрацентрифугирование, ультрафильтрация, пенная флотация и др.).

Физико-химические методы (преципитация этиловым спиртом, сульфатом аммония, сульфатом алюминия, двухвалентными катионами, преципитация в изо- электрической точке вирусного белка, концентрация полиэтиленгликолем).

Адсорбционные методы (адсорбция на марлевом тампоне, природных минеральных сорбентах — бентоните и других ионообменных смолах).

Биологические методы (адсорбция на дрожжевых клетках и других микроорганизмах).

Наиболее надежным методом концентрации вирусов является метод ультрацентрифугирования, однако этот метод не всегда доступен для вирусологических лабораторий. Чаще применяют методы ультрафильтрации, методы концентрации вирусов с помощью полиэтиленгли- коля и адсорбционные методы — адсорбцию на марлевом тампоне и ионообменных смолах. Эти методы отличаются простотой, скоростью и достаточной эффективностью.

Для выделения вируса заражают культуру клеток или лабораторных животных (мышей-сосунков). Питьевая вода, безопасная в отношении вирусных инфекций, должна содержать менее одной вирусной частицы в 1 л. Однако эти требования не распространяются на вирус гепатита А и ротавирусы, которые могут быть обнаружены только с помощью малодоступных для вирусологических лабораторий методов.

47. Санитарная вирусология предметов  обихода. Предметы обихода могут быть посредниками в переносе вирусных агентов от больного к здоровому человеку. Особенно. велика роль предметов обихода в детских учреждениях в связи с тесным контактом детей. Вирусы могут быть выделены из смывов с различных предметов обихода в детских учреждениях, больницах — игрушек, посуды, кухонного инвентаря, ткани, стекла, дерева, рук обслуживающего персонала. Аденовирусы типа 5 и вирусы ECHO 7 сохраняют инфекционную активность на некоторых предметах обихода более 7 суток, а вирусы пара-гриппа и респираторно-синцитиальный в течение нескольких минут или часов. Аденовирусы и энтеровирусы могут с предметов обихода поступать вторично в воздух и распространяться в виде пылевой фазы аэрозоля.

Исследование смывов с предметов обихода на наличие вирусов проводится по эпидпоказаниям в детских садах, яслях, больницах и других учреждениях. Смыв берут с поверхности предметов с помощью стерильного тампона, который помещают в пробирку с жидкостью (раствор Хенкса, гидролизат лактальбумина). Тампон отжимают и вирус из жидкости концентрируют с помощью фильтрации через фильтры из материала ФП или с помощью осаждения сульфатом алюминия.

48. Санитарная вирусология почвы. Кишечные вирусы могут адсорбироваться подзолистыми почвами, однако в результате действия ряда факторов могут десорбироваться и снова поступать в окружающую среду. Таким путем кишечные инфекции могут передаваться через почву и овощи при использовании зараженных вирусами сточных вод на полях орошения, огородах и приусадебных участках (сточные воды -> почва -> овощи -> человек). Кишечные вирусы длительное время сохраняются на овощах. Выживаемость их зависит от вида растения, условий вегетации, типа вируса и его исходной концентрации. Так, вирус полиомиелита типа I при температуре 6—10° С выживал на редисе в течение 2 мес. Из овощных культур наиболее быстрая инактивация вирусов происходит на капусте в результате ее фитонцидной активности.

Инфицирование овощей может происходить не только путем попадания вирусов на их поверхность, но также и путем проникновения вируса из почвы в наземные части овощных культур через корневую систему. Поэтому необходимо систематическое проведение санитарно-виру-сологических исследований поливной сточной воды, почвы и продукции полей орошения на присутствие кишечных вирусов. Благодаря быстрой адсорбции вирусов частицами почвы наиболее вероятна локализация вирусов в верхнем (пахотном) слое (0—25 см), однако важно бывает определить проникновение вирусов и в более глубокие слои (75—100 см).

Исследование почвы проводят по эпидемиологическим показаниям. Образцы почв (10—20 г) отбирают искателем с глубины 0—20 см в нескольких точках намеченного участка. Пробы смешивают и доставляют в лабораторию в стерильном полиэтиленовом мешке.

Обработка почвы включает десорбцию вирусов с по-верхности частиц почвы в жидкую фазу (фосфатный буфер, pH 8,2), концентрирование вирусных частиц с помощью фильтрации жидкой фазы через фильтры из материала ФП или с помощью осаждения сульфатом алюминия. Так же обрабатывают и осадок сточных вод.

49. Санитарная вирусология воздуха. Воздушно-капельный путь передачи инфекции характерен для инфекций дыхательных путей — наиболее массовых инфекционных заболеваний. Вирусы попадают в воздух в виде капельной фазы аэрозоля в результате чиханья, кашля, разговора и находятся в составе капель различной величины, состоящих из слюны, слизи и солей. В наиболее высоких концентрациях вирус содержится в крупных каплях, которые мало устойчивы в аэрозоле и быстро оседают. Более длительное время во взвешенном состоянии находятся мелкие капли вирусного аэрозоля. Высыхание капель аэрозоля сопровождается инактивацией вируса.

Заражение респираторными вирусами в основном осуществляется за счет капельной фазы аэрозоля в закрытых помещениях. В первую очередь заражаются восприимчивые люди, находящиеся в непосредственной близости от больного. Менее опасно вдыхание высохших капель, в которых часть вирусных частиц уже инактивирована. Концентрация частиц в аэрозольном облаке уменьшается за счет разведения большими объемами воздуха и оседания крупных капель аэрозоля. Вместе с тем наличие в аэрозоле мелких капель дает возможность вирусу проникать в нижние отделы дыхательных путей. Инфекционный агент может переноситься токами воздуха на значительные расстояния — десятки километров от очага инфекции. Распространение вирусов зависит от скорости ветра; напротив, дождливая погода ограничивает распространение вирусов.

Устойчивые во внешней среде вирусы, в первую очередь аденовирусы, могут с пылевой фазой аэрозоля многократно поступать в воздух и длительно циркулировать в данном помещении.

По устойчивости вирусов в аэрозоле и на поверхностях их можно разделить на две группы: малоустойчивые вирусы, такие как парамиксовирусы (вирусы парагриппа и особенно респираторно-синцитиальный вирус) и несколько более устойчивые вирусы гриппа, которые пере-даются от больных людей здоровым только в виде капельной фазы аэрозоля, и устойчивые вирусы, такие как аденовирусы и ECHO вирусы, которые проникают в организм не только в виде капельной фазы, но и пылевой фазы аэрозоля.

Методы концентрации вирусов из воздуха. Для изучения микрофлоры воздуха — бактерий и плесневых грибов — существуют различные методы исследования и созданы многочисленные приборы для концентрации этих микроорганизмов из воздуха. Некоторые из приборов с соответствующими модификациями применяются и для концентрации вирусов из воздуха.

Поскольку вирусы, как правило, находятся в воздухе закрытых помещений в низкой концентрации, не позволяющей непосредственно их выделить, необходима предварительная концентрация вирусов из воздуха. Наиболее благоприятные условия для улавливания вирусного аэрозоля с сохранением инфекционной активности вирусов создаются путем концентрирования их в жидкой среде при соответствующем подборе улавливающей жидкости. Одним из наиболее эффективных приборов для выделения микроорганизмов из воздуха с целью исследования его бактериальной зараженности является бактериоуло- витель Речменского, а также приборы ПОВ-1 и ПАБ-1, в которых в качестве жидкой среды используются сахарный бульон или гидролизат лактальбумина. Улавливающую жидкость используют как материал для выделения вирусов либо проводят дальнейшую концентрацию вируса, добавляя в пробирки с улавливающей жидкостью 30% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 или 6000. После центрифугирования суспензии удаляют верхний слой жидкости и анализируют вирус-содержащий нижний слой.

Помимо улавливания на жидких средах, для концентрации вирусов из воздуха могут быть использованы фильтры из материала ФП. С поверхности фильтров вирусы смывают жидкой средой с антибиотиками.

Выживаемость вирусов в воздухе. Определение длительности выживания в воздушной среде различных респираторных вирусов является актуальным вопросом в связи с воздушно-капельным путем распространения респираторных инфекций. В экспериментальных исследованиях длительность выживаемости вирусов в аэрозольном состоянии зависит от таких факторов, как температура и относительная влажность воздуха, свет, состав улавливающей жидкости и т. д.

В закрытых помещениях основным фактором, влияющим на скорость инактивации вирусов в аэрозоле, является относительная влажность воздуха. Вирусы в различной степени устойчивы к показателям относительной влажности. Вирусы гриппа, парагриппа и респираторносинцитиальный вирус быстрее инактивируются при высокой относительной влажности и в меньшей степени — при низкой. Напротив, вирус полиомиелита, вирусы ECHO и аденовирусы более устойчивы в воздухе при высокой относительной влажности и быстрее инактивируются при низкой относительной влажности. Вирусы везикулярного стоматита и кори устойчивы как при низкой, так и высокой относительной влажности и быстрее инактивируются при средней относительной влажности.

50. Реакция связывания комплемента. РСК заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и ATсоответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Протекание реакции

Реакция протекает в две фазы с участием двух систем; бактериальной и гемолитической. В первой реакции (специфическая) участвуют антиген 4-+ антитело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген — антитело с адсорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался. Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента. Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1—2 ч) или в холодильнике при 3—4°С (18—20 ч). При длительном образовании иммунного комплекса антиген-антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается. При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад. В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100—500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 °С в течение 1—2 ч. Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная). При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).

Компоненты

Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм реакции

РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.

Применение

Реакцию связывания комплемента можно применять для:

1) выявления  специфических антител в неизвестной  сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной природы;

2) изучения  свойств антигена в реакции  с известной специфической сывороткой. Подготовка ингредиентов для  постановки РСК.

1. Сыворотку  крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3—4°С в течение 5—6 дней. В день постановки-опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:5 (0,1 мл исследуемой сыворотки,+ 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).

2. Антигеном  для постановки РСК могут быть  культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.

3. Комплементом  является смесь сывороток, полученная  от 3—5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах.

Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида «атрия в отношении 1 : 10, получая основной раствор.