Шпаргалка по «Вирусологии»

29. Методы индикации элементарных  телец и телец-включений. Обычно удается рассмотреть вирионы вирусов и установить их структуру с помощью электронной микроскопии, позволяющей различать объекты размерами до 0,2-0,4 нм. Обнаружение с помощью электронной микроскопии в материале от больных животных вирионов может служить доказательством наличия вирусов в этом материале и в некоторых случаях используется для диагностики вирусных болезней. Но этот метод технически сложный и дорогостоящий, не позволяет точно идентифицировать обнаруженный вирус. В световой микроскоп удается увидеть только вирионы оспенных вирусов на пределе видимости. Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, структура, местоположение в клетке телец-включений, образованных разными вирусами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образованы, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале. Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с последующей микроскопией. Для телец-включений, образуемых разными вирусами, методы окраски различны. Разработано много рецептов окраски. Среди них есть и универсальные, к которым относится окраска гематоксилин-эозином.

30. Методы заражения и вскрытия  лаб.ж-х. Для изучения патологоанатомических изменений и получения вируссодержащего материала экспериментально зараженных животных вскрывают. Делают это сразу же после гибели их, что предотвращает обсеменение органов и тканей микрофлорой, находящейся при жизни животного на поверхности слизистых оболочек, особенно в кишечнике. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального проявления симптомов болезни или при их отсутствии на 8–10-й день после заражения.

Для удобства вскрытия труп животного фиксируют. Более крупных животных укрепляют на специальных вскрывочных столиках или на доске с приспособлением для фиксации конечностей и головы. Мелких животных целесообразно фиксировать в кювете с залитым воском (парафином) и покрытым бумажной салфеткой дном. Для фиксации используют инъекционные иглы или одностержневые булавки (портновские). Вскрытие выполняют стерильными инструментами.

Брюшную и грудную полости вскрывают при фиксации животного в спинном положении с направленными в стороны и укрепленными передними и задними конечностями .

Шерсть животного по линии разреза обрабатывают дезинфицирующим раствором. Мелких животных перед вскрытием можно опускать полностью в дезинфицирующий раствор, держа за хвост.

Разрез кожи делают по белой линии от лонной кости (симфиза) до шеи. Чтобы при этом не прорезать брюшную стенку, пинцетом, находящимся в левой руке, приподнимают кожу и делают сначала поперечный надрез складки кожи, удерживаемой пинцетом у симфиза, а затем, вставив одну браншу ножниц в образовавшееся отверстие, разрезают кожу до шеи животного, после чего кожу разрезают по направлению к каждой из четырех конечностей. Тупым путем кожу отпрепаровывают, открывая ее лоскуты вправо и влево наподобие дверок шкафа. Лоскуты кожи фиксируют булавками за верхние и нижние углы.

Заменив инструменты, вскрывают брюшную полость. Для этого разрез брюшной стенки делают под линией диафрагмы и по белой линии до лонной кости. Треугольники брюшной стенки отводят в стороны и фиксируют.

В качестве вируссодержащего материала из брюшной полости берут кусочки (или целый орган у мелких животных) печени, селезенки, почки, брыжеечные лимфатические узлы, участок кишечника при наличии патологоанатомических изменений или симптомов болезни, наблюдавшихся перед смертью.

Грудную полость вскрывают с учетом того, что она имеет твердые стенки. Для получения доступа к находящимся в ней органам с нее надо как бы снять «крышку». Для этого разрезают ребра поперек сзади вперед, удаляя их вместе с грудной костью.

Череп вскрывают, укрепив животное в брюшном положении путем фиксации передних конечностей и головы (рис. 13). Кожу головы и шеи обрабатывают дезинфицирующим раствором.

Разрез кожи делают перпендикулярно оси тела за ушами, продолжают слева и справа вперед к глазницам. Кожу вместе с ушами отпрепаровывают и отбрасывают вперед, оголяя черепную коробку. Одну браншу ножниц вставляют в большое черепное отверстие и режут кости черепа влево и вправо по направлению к глазницам. Затем разрезают кости черепа между глазницами и удаляют весь вырезанный участок. Если кости черепа толстые, их распиливают по тем же направлениям. Можно разрезы черепа вести от глазниц назад.

Мозг животных, имеющий мажущуюся мягкую консистенцию, извлекают из основания черепа, подняв его слегка раздвинутыми браншами ножниц и подрезав черепно-мозговые нервы.

Основное требование к вируссодержащему материалу–максимальное содержание в нем вируса, что определяется тропизмом вируса, т.е. способностью его размножаться в определенном типе клеток, а следовательно, и в соответствующих органах животного. Поэтому, вскрывая животное, обращают внимание на то, какие органы имеют патологоанатомические изменения, т.е. предположительно содержат вирус. Измененные органы берут в качестве вируссодержащего материала. Одновременно с той же целью берут регионарные пораженному органу лимфатические узлы.

При заражении животных пневмотропными вирусами в качестве вируссодержащего материала берут легкие, средостенные лимфатические узлы, трахею. Висцеротропные вирусы содержатся в паренхиматозных органах брюшной полости (в печени, селезенке), брыжеечных лимфатических узлах и стенке кишечника. Для исследований нейротропных вирусов берут головной, а если надо, то и спинной мозг.

Каждую пробу материала, разделив на две части, помещают отдельно в две стерильные пробирки, закрытые резиновыми пробками. Ткань одной пробирки предназначается для вирусологических исследований, поэтому ее сразу же заливают соответствующим фиксатором. В тех случаях, когда в комплексе диагностических исследований на определенную инфекцию предполагаются микроскопические методы обнаружения вируса (световая, люминесцентная микроскопия), из вируссодержащих органов делают мазки или отпечатки. Учитывая, что специфические для вируса изменения могут быть локализованы в различных отделах органа (например, в мозге при бешенстве), отпечатки готовят следующим образом: мозг мелкого животного из вскрытой черепной полости, не повреждая структуры, переносят на лист (10x10 см) фильтровальной бумаги, где он достаточно прочно фиксируется. Браншами глазных ножниц отрезают по вертикальной плоскости небольшой кусочек его и кладут на бумагу рядом. Затем отрезают следующий слой мозга и также кладут рядом и т. д. Взяв в левую руку лист бумаги с фиксированными на нем кусочками мозга, правой рукой прикладывают сверху к каждому поочередно предметное обезжиренное стекло, получая отпечатки.

31. Строение и методы заражения  развивающихся кур.эмбрионов. Используют КЭ в вирусологии в основном для тех же целей, что и ЛЖ: обнаружения в патматериале активного вируса биопробой; первичного выделения вируса; поддержания вирусов в лаборатории; титрования вирусов; накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин; как тест-объект в реакции нейтрализации.

Строение: 1.Скорлупа 2.Подскорлупная оболочка 3.Воздушная камера 4.Аллантоисная полость 5.Желточный мешок 6.Альбуминный мешок 7.ХАО – хорион-аллантоисная оболочка 8.Амниотическая полость 9.Эмбрион 10.Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной). С 5-12день КЭ могут использоваться для заражения

1) Скорлупа  и подскорлупная оболочка служит  хорошей защитой от факторов внешней среды. 2)КЭ содержат субстрат для выращивания вируса. 3)КЭ устойчивы к воздействиям связанных с выделением исследуемого материала. 4)КЭ легко доступны, экологичны, не требуют ухода, кормления, не образуют АТ.

6 методов  заражения КЭ: 1)Заражение в аллантоисную полость (грипп, болезнь Ньюкасла). КЭ фиксируют вертикально тупым концом вверх, на стороне зародыша на 5-6мм выше границы воздушной камеры делают отверстие 1мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. 2)на ХАО (оспа, чума плотоядных): а)Ч/з естественную воздушную камеру. КЭ в штатив тупым концом вверх, в скорлупе против центра воздушной камеры окно 15-20мм. Снимают подскорлупную оболочку. На ХАО наносят 0,2 мм суспензии. Отверст. лейкопластырем. б)Ч/з искусственную воздушную камеру. Штатив горизонтально зародышем вверх. Делают 2 отверстия: над центром воздушной камеры, другое 0,2-0,5см сбоку, со стороны зародыша. Из первого зародыша отсасывают воздух, образуется искусственная воздушная камера, дном которого является ХАО, на него наносят инфекционную жидкость, заклеивают лейкопластырем. 3)В желточный мешок (хламидий, б. Марека): а)КЭ помещают в штатив вертикально. Отверстие над центром воздушной камеры, иглу на 3,5-4см под углом 45, противоположно месту нахождения зародыша. б)аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном штативе КЭ; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. 4)В амниотическую полость (грипп, болезнь Ньюкасла): закрыт способ – зародыш. вверх. Иглу вводят затупленным концом по направлению к зародышу откр. способ – над воздушной полостью отверстие 1,5-2,5см. Удаляют подскорлупную оболочку. Пинцет продавливают ХАО по направлению к зародышу. Затем амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну, водят туда суспензию. Отпускают. Лейкопластырь. 5)Заражение в тело зародыша. 6)в кровеносные сосуды.

32. Классиф.культур клеток. Культура клеток (КК) – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика культивирования особенно успешно стала развиваться после 40-х годов. Этому способствовали следующие события: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение КК, открытие Хангом и Эндерсом способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток. Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных КК. Применяют следующие КК: 1) ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие invitroв один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. 2) Субкультуры – их часто используют и получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой. Они по чувствительности не уступают ПТКК, более экономичны. 3) Перевиваемые КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лаборатория их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получают их из первичных КК с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом , стабильны в условиях ростаinvitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. «+» перед первичными – проще готовить, заранее можно проверить на наличие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспечивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Но они склонны к злокачественному перерождению. 4)Диплоидные КК – морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивированияinvitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. 5)Суспензионные КК – перевиваемые культуры клеток в суспензии.

33. Получение первично-трипсинизированных  культур клеток. ПЕРВИЧНО-ТРИПСИНИЗИРОВАННЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК– клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие invitroв один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. С помощью метода КК были решены некоторые теоретические вопросы – о взаимодействии вируса с клеткой, месте репродукции вирусов, механизме антивирусной иммунизации. В настоящее время КК применяют для выделения вирусов из патматериала, их индикации, идентификации, для постановки реакции нейтрализации, определения титра вирусов, для приготовления диагностических АГ и вакцин, в качестве тест – объектов в реакции нейтрализации.

34. Титрование вирусов по инфекционному  действию. Титр вируса — это количество вируса в единице объема вируссодержащего материала. Выражают титр через количество так называемых «эффективных доз вируса». Одна эффективная доза (ЭД) — это минимальная доза вируса, дающего регистрируемый эффект в чувствительной системе. Наиболее статистически достоверной является эффективная доза (ЭД50), оказывающая действие на 50 % экспериментальных объектов [лабораторные животные, куриные эмбрионы (КЭ), пробирки с культурами клеток]. Обозначение эффективных доз вируса обусловлено видом вируса, биологической системой, на которой его титруют, формой проявления его инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ТЦД50): 1 ЛД5о — доза вируса, вызывающая гибель 50 % животных; 1 ЭЛД50 — доза вируса, вызывающая гибель 50 % зараженных КЭ; 1 ИД50 — доза вируса, вызывающая клиническую картину поражения у 50 % зараженных лабораторных животных; 1 ЭИД50 — доза вируса, обусловливающая регистрируемый патологический процесс у 50 % зараженных куриных эмбрионов (КЭ); 1 ТЦД50 - доза вируса, дающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (КК). Условия титрования вируса по инфекционному действию включают приготовление его 10-кратных разведений и заражение каждым разведением не менее четырех живых тест-объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток). Экспериментально установлено, что инфекционное действие вируса при его 10-кратном разведении (обычно в растворе Хенкса) уменьшается пропорционально десятичному логарифму разведения: если вируссодержащий материал развести в 100 раз, то инфекционное действие вируса уменьшается в два раза, если развести в 1000 раз — в три раза и т. д.; интервал составляет 1. Вируссодержащую взвесь разводят раствором Хенкса, или физиологическим раствором, или различными жидкими средами в зависимости от вида вируса, рН растворов (около 7,0). Для получения последовательных 10-кратных разведений в пронумерованные пробирки с пробками наливают по 9 мл стерильного раствора, затем в первую пробирку вносят пипеткой ровно 1 мл исследуемой вирусной суспензии, не касаясь поверхности раствора, и убирают пипетку в дезинфицирующий раствор. Новой стерильной пипеткой перемешивают смесь в первой пробирке, набирают 1,0 мл смеси и вносят во вторую пробирку и т. д. Из последней пробирки 1,0 мл смеси удаляют в дезинфицирующий раствор. Вирусом каждого разведения заражают группы с одинаковым числом чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (животных, куриных эмбрионов, культур клеток) с учетом тропизма вируса. Статистические методы обработки результатов титрования позволяют учесть все колебания чувствительности вируса к используемым живым системам и доказать достоверность дозы вируса, способной вызвать строго определенный инфекционный эффект. Метод Рида и Менча. Наиболее часто применяют статистический метод Рида и Менча, который основан на построении кумулятивных рядов на основе полученных данных. Для примера рассмотрим результаты титрования вируса на белых мышах, расчет кумулятивных данных и процента гибели мышей (доза заражения 0,2 мл). При расчете кумулятивных данных (графа 1) число мышей, павших от более высокого разведения (графа 4), следует прибавить к числу павших от более низкого разведения. При расчете кумулятивных данных (графа 5) число мышей, оставшихся в живых от более низкого разведения, прибавляют к числу животных, не погибших от более высокого разведения. Летальность (%) вычисляют для каждого разведения вируса по кумулятивным данным: Летальность = (100 * число павших) / (павшие + выжившие) Средняя эффективная доза вируссодержащего материала, вызывающая гибель 50 % животных, находится между разведениями 10 в -5 и 10 в -6 (графа 1), обусловливающими соответственно 60 и 20 % летательности (графа 8). Определяют логарифм искомого разведения (ЛД50) т. е. вызывающею 50 % гибели животных: lgЛД50=В+(В-50)/(В-а)lgd, где В — разведение, дающее эффект более чем в 50 % случаев; в — процент, соответствующий разведению В; а — процент, соответствующий разведению, дающему эффект менее чем в 50 % случаев; d— коэффициент разведения (так как разведение в данном примере 1:10, то коэффициент равен 10).