36. Метод расчета титра по
Риду и Менчу. Метод Рида и Менча.
Наиболее часто применяют статистический
метод Рида и Менча, который основан на
построении кумулятивных рядов на основе
полученных данных.
Для примера
рассмотрим результаты титрования вируса
на белых мышах, расчет кумулятивных данных
и процента гибели мышей (доза заражения
0,2 мл). При расчете кумулятивных данных
число мышей, павших от более высокого
разведения, следует прибавить к числу
павших от более низкого разведения. Летальность
вычисляют для каждого разведения вируса
по кумулятивным данным Летальность
= 100х число павших/ (павшие + выжившие)
37. Реакция торможения гемагглютинации.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
— серологический метод, широко используемый
для обнаружения вирусного гемагглютинина
(гемагглютинирующего вируса) или отличий
в его структуре у различных вирусов с
помощью антигемагглютинирующих антител,
образовавшихся в организме животных
и человека в процессе болезни или в результате
иммунизации. РТГА впервые предложена
Херстом в 1941 г. для вирусов гриппа в США,
обнаружившим у них способность агглютинировать
эритроциты. Позже обнаружили, что многие
вирусы обладают гемагглютинирующей активностью,
и РТГА начали широко применять как для
идентификации вирусов, так и для серологического
подтверждения вирусной природы болезни
путем обнаружения антител. РТГА основана
на том, что при контакте вируса с гомологичными
(специфическими) антителами происходит
связывание антител с гемагглютининами
вируса, образуется комплекс «антиген+
антитело». При этом нейтрализуется не
только инфекционная, но и гемагглютинирующая
активность вируса, в результате чего
вирус теряет свойство агглютинировать
(склеивать) эритроциты. Для постановки
РТГА необходимы следующие компоненты:
1) известный или неизвестный вирусный
антиген (гемагглютинирующий вирус) в
рабочей дозе 4 АЕ (4 агглютинирующие единицы
вируса в объеме 0,25 мл физиологического
раствора; 2) неизвестная исследуемая или
известная диагностическая сыворотка
крови, прогретая при 56 °С в течение 30 мин
для ингибирования термолабильных ингибиторов;
3) нормальная сыворотка крови — контрольная,
не содержащая специфических антител;
4) взвесь эритроцитов 0,5...1%-я; 5) физиологический
раствор (0,85%-й); рН 7,2. Различают следующие
методы постановки РТГА: 1) с исследуемой
неизвестной сывороткой крови животных
и человека, из которой удалены неспецифические
ингибиторы вирусов, и известным гемагглютинирующим
вирусом (вирусным антигеном) для обнаружения
специфических противовирусных антител;
2) с неизвестным вируссодержащим материалом
(вирусом) и известной диагностической
иммунной сывороткой для идентификации
(определение вида) выделенного вируса.
Методика постановки РТГА с исследуемой
сывороткой крови. Для постановки реакции
используют плексигласовые пластинки
с лунками объемом 1 мл РТГА в следующей
последовательности: 1. Из исследуемой
сыворотки крови делают ряд двукратных
разведений (1: 10, 1: 20, 1: 40, 1: 80, 1: 160 ...1: 1280
и т.д.). Для этого во все лунки, кроме первой,
разливают по 0,25 мл физиологического раствора,
а в первую — 0,45 мл. В первую лунку добавляют
0,05 мл исследуемой сыворотки крови, из
которой удалены ингибиторы вирусов. После
тщательного перемешивания из пер вой
лунки переносят 0,25 мл во вторую, перемешивают
и из второй 0,25 мл переносят в третью и
т. д. Таким образом получают ряд разведений
сыворотки крови. 2. В каждую лунку с разными
разведениями исследуемой сыворотки крови
добавляют по 0,25 мл вирусного известного
антигена (гемагглютинирующего вируса),
содержащего в этом объеме 4 АЕ вируса.
Дозу вируса определяют раньше в РГА. 3.
Контакт вируса с антителами при комнатной
температуре составляет от 30 до 60 мин в
зависимости от видов вирусов. 4. По истечении
времени контакта вируса с антителами
во все лунки добавляют по 0,5 мл 0,5...1%-й
взвеси эритроцитов, осторожно перемешивают
и оставляют при комнатной температуре
на 30...60 мин. 5. Результаты РТГА учитывают
по отсутствию склеивания эритроцитов.
При положительной РТГА на дне лунки будет
плотный дискообразный осадок эритроцитов,
выпавших под своей тяжестью. Обязательно
ставят контроль в одной лунке со следующими
компонентами: 1) 0,25 мл неизвестного вируса
в дозе 4 АЕ; 2) 0,25 мл физиологического раствора
вместо исследуемой сыворотки крови; 3)
0,5 мл взвеси эритроцитов. Результат контроля
— осадок эритроцитов в виде развернутого
зонтика на дне лунки, что означает отрицательную
реакцию торможения гемагглютинации.
Известно, что механизм реакции гемагглютинации
основан на способности гемагглютинирующих
вирусов адсорбироваться на поверхностных
рецепторах эритроцитов различных видов
животных и птиц, В результате такой адсорбции
эритроциты склеиваются друг с другом
и выпадают в осадок в виде развернутого
зонтика на дне лунки — это положительная
РГА. Первое отличие РТГА от РГА: если суспензию
эритроцитов внесли в жидкость без гемагглютинирующего
вируса, то эритроциты оседают в виде небольшого
красного плотного осадка с четкими краями.
Второе отличие между двумя этими реакциями
заключается в том, что РТГА позволяет
идентифицировать выделенный вирус, а
РГА — лишь обнаруживать наличие гемагглютинирующего
вируса в исследуемом материале. С помощью
РТГА при многих вирусных болезнях проводят
ретроспективную диагностику, обнаруживают
прирост антител в сыворотках крови реконвалесцентов
(переболевших) по сравнению с сыворотками
крови, полученными в первые дни заболевания.
По приросту антител оценивают эффективность
иммунизации и качество вакцин. Используют
РТГА и для определения видов неизвестных
вирусов, выделенных из вируссодержащего
материала при диагностике вирусных болезней
человека, животных и птиц.
38. Реакция нейтрализации. Принцип
реакции нейтрализации состоит в следующем.
Этапы постановки: в пробирке смешивают
равные объемы вирусного антигена (суспензия
вируса, вируссодержащего материала) и
известной иммунной или неизвестной исследуемой
сыворотки крови; эту смесь выдерживают
при определенной температуре и длительности
по времени, что зависит от вируса. Затем
этой смесью заражают живые биологические
системы (постановка биологической пробы),
которые подбирают с учетом наилучшего
культивирования данного вируса. Если
во взятой сыворотке крови содержатся
антитела, то вирус будет нейтрализован
антителами сыворотки и биологическая
проба окажется отрицательной, что будет
свидетельствовать об образовании комплекса
«антиген+антитело», а результат реакции
нейтрализации даст положительный диагностический
ответ.
Результаты
РН учитывают по отсутствию:
1. гибели,развития
клинической картины болезни
и пат изменений в органах и
тканях лаб животных
2. гибели, пат
изменениях в оболочках и гемагглютининов
в жидкостях полостей куриных
эмбрионов
3. цитопатического
действия или бляшкообразования
в культуре клеток
Для постановки
РН нужны след компоненты:
1. вирусный
АГ - суспензия известного вируса или неизвестный
вируссодержащий материал
2. спецефические
вируснейтрализующие АТ
3. живые
биологические системы- лаб животные,
куриные эмбрионы и культуры
клеток
4. норм сыворотка
крови, не содержащая специфические
АТ, для контроля
Реакцию нейтрализации
применяют с целью:
1. идентификации
выделенного неизвестного вируса
с помощью известных специфических
АТ, содержащихся в диагностической
гипериммунной сыворотке крови
2. обнаружения
и титрования неизвестных противовирусных
АТ в исследуемой сыворотке крови
с помоom. известного вирусного АГ
3. определения
количественного содержания АТ
в лечебных, профилактических и
диагностических препаратах.
39. Диффузная преципитация. РДП
в геле основана на способности к диффузии
в гелях АТ и растворимых АГ и отсутствие
такой способности у комплекса «АГ+АТ».
Этот комплекс образуется при контакте
диффундирующих навстречу друг другу
гомологичных АГ и АТ. Он осаждается на
месте образования в толще геля в виде
полосы преципитации. В качестве геля
используют крахмал, желатин, агар-агар
и другое. В лабораторной практике очень
часто используют агаровый гель. АТ сыворотки
представляют собой молекулы Ig, которые,
несмотря на довольно крупные размеры.
Способны диффундировать в агаровом геле.
АГ вирусов – это вирусные белки. Они могут
находится в составе вирионов, представляя
так называемые корпускулярные АГ. Крупные
размеры которые не позволяют им диффундировать
в агаровом геле. Но белки вирусов могут
быть и в виде свободных молекул, образующихся
в результате деструкции вирионов и (или)
разрушения клеток, в которых они образовались.
Это растворимые АГ. Они способны к диффузии
в агаровом геле. Методика постановки
РДП в геле состоит в том, что в слое агарового
геля делают несколько углублении и в
них наливают АГ и сыворотки так. Чтобы
АГ и сыворотка были в соседних лунках.
Из лунок АГ и сыворотки начинают диффундировать
в слой геля. Диффузия направлена во все
стороны от каждой лунки. В пространстве
между лунками, содержащими АГ и сыворотку,
последние диффундируют навстречу друг
другу. Если они окажутся гомологичными,
то образуется комплекс «АГ+АТ», который
к диффузии не способен вследствие более
крупных размеров. Он оседает на месте
образования в виде беловатой полосы преципитации.
РДП решает задачи: 1) обнаружение в сыворотке
крови АТ, гомологичных АГ; 2) обнаружение
в материале АГ, гомологичного известным
АТ сыворотки;3) идентификация неизвестного
вируса; 4) титрование АТ сыворотки. Здесь
высшее разведение сыворотки, еще дающее
преципитацию с гомологичным АГ, служит
показателем титра АТ в сыворотке. РДП
часто используют для диагностики лейкоза
КРС и инфекционной анемии лошадей. Реакция
м\б поставлена в чашках Петри, на предметных
стеклах, капиллярах (редко). Для осуществления
РДП на предметных стеклах нужны: обезжиренные
предметные стекла, градуированные пипетки
(2-5 мл), пастеровские пипетки; трубка диаметром
5мм или штамп, влажная камера, инструмент
для извлечения из лунок геля, агар, АГ,
сыворотки. Постановка РДП: Предметные
стекла кладут на холодную поверхность.
Из пипетки наливают агар (слой 1,5-2 мм),
дают остыть 5-10 минут. Вырезают лунки,
запаивают их. В лунки заливают компоненты
РДП, помещают во влажную камеру (где оставляют
при комнатной температуре или ставят
в термостат). Препарат РДП на предметных
стеклах можно через 48-72 часа высушить
и окрасить раствором амидного черного.
Это позволяет сохранить препарат неопределенно
долго и улучшает возможность фотографировать
полосы преципитации. Плюсы РДП: простота
техники постановки, быстрота получения
ответа, нетребовательность к чистоте
компонентов, не требуется стерильной
работы, минимальная потребность в компонентах,
пригодность для работы с любыми растворимыми
АГ, возможность документирования результата
путем фотографирования. Минусы РДП: низкая
чувствительность. Реакцию ставят для
обнаружения в патматериале вирусов бешенства,
инфекционного ринотрахеита КРС, африканской
чумы свиней, чумы собак, других; А также
для идентификации вирусов инфекционной
анемии лошадей, аденовирусов, респираторно-синцитиального
вируса, вируса диареи КРС, для обнаружения
в сыворотках крови АТ к вирусам инфекционной
анемии лошадей, респираторно-синцитиального
вируса КРС и во многих других случаях.
40. Реакции непрямой гемагглютинации.
Принцип РНГА впервые обоснован в конце
40-х годов ХХ в., когда нативные эритроциты
были использованы для адсорбции бактериальных
антигенов полисахаридной природы. Позже
установили, что они приобретают способность
адсорбироваться на эритроцитах, предварительно
обработанных танином по Бойдену. РИГА
по Бойдену получила наиболее широкое
распространение. В вирусологии ее используют
главным образом для титрования антител.
Эритроциты для этого варианта реакции
несут на своей поверхности вирусные антигены.
Другой тип РИГА, в основу которого положена
адсорбция антител на поверхности эритроцитов
с последующей их агглютинацией в присутствии
гомологичного антигена, предложен в 1956
г. (Бойден, Соколов и Мидддбрук—Дюбо).
С применением эритроцитов, сенсибилизированных
антителами по методике Бойдена, открылась
возможность быстрого обнаружения антигенов
в различных субстратах. Таким образом,
сущность реакции непрямой гемагглютинации
состоит в том, что эритроциты, на поверхности
которых предварительно адсорбированы
антиген (вирус) или противовирусные антитела,
приобретают способность агглютинироваться
(склеиваться) в присутствии гомологичных
сывороток (антител) или антигенов (вирусов).
Эритроциты при этом выполняют роль носителей,
агглютинация которых происходит при
взаимодействии антиген+антитело; результат
регистрируют невооруженным глазом по
характеру сформированного осадка или
агглютининов. Главное достоинство РНГА
— высокая чувствительность и специфичность,
техническая простота, стабильность используемых
компонентов, что обеспечивает надежную
воспроизводимость результатов и возможность
работы вне постоянной связи с вирусологической
лабораторией. Для постановки РНГА необходимы
определенные компоненты. 1. Известные
«эритроцитарный антигенный .диагностикум»,
содержащий определенный вирус, и «иммунноглобулиновый
эритроцитарный диагностикум», содержащий
определенные противовирусные антитела.
2. Исследуемая (неизвестная) сыворотка
крови животных и человека. 3. Нормальная
сыворотка для контроля. 4. Исследуемый
(неизвестный) вируссодержащий материал.
5. Нормальный физиологический раствор,
содержащий 1 % кроличьей сыворотки крови
для разведения компонентов реакции. 6.
Заведомо положительная сыворотка крови,
содержащая известные противовирусные
антитела для контроля. 7. Эритроциты нормальные,
т. е. сенсибилизированные вирусом или
антителами для контроля. В настоящее
время РНГА широко используют для диагностики
ряда вирусных болезней животных и человека.
В ветеринарии ее применяют при инфекционном
бронхите и лейкозе кур, инфекционном
ринотрахеите и аденовирусной инфекции
крупного рогатого скота, болезни Ауески
животных и инфекционном гастроэнтерите
свиней, при классической чуме свиней
(на стадии внедрения). При диагностике
вирусных болезней РНГА применяют для:
1) обнаружения и титрования противовирусных
антител в исследуемой сыворотке крови
с помощью известного эритроцитарного
вирусного диагностикума; 2) идентификации
выдленного неизвестного вируса с помощью
известного иммуноглобулинового эритроцитарного
диагностикума, содержащего известные
противовирусные антитела. Разработаны
два метода постановки РНГА: макроскопический
и микроскопический. Подготовительная
работа перед постановкой реакции заключается
в приготовлении взвеси эритроцитов (барана
или человека О-группы): 1) фиксация эритроцитов
формальдегидом, глутаровым или акриловым
альдегидами: эритроциты в течение длительного
времени не подвергаются гемолизу; 2) обработка
фиксированных эритроцитов танином, в
результате чего эритроциты приобретают
свойство необратимо адсорбировать на
своей поверхности белки (вирусы и антитела)
и повышается их устойчивость к гемолитическому
действию не которых солей жирных кислот;
З) сенсибилизация фиксированных и танизированных
эритроцитов вирусами или противовирусными
антителами. Все эти этапы подготовки
эритроцитов осуществляются на биологических
комбинатах, фабриках или в вирусологических
лабораториях. Методика и последовательность
постановки РНГА для обнаружения противовирусных
антител и определения их титра в исследуемой
сыворотке макроскопическим способом.
1. делают двукратные разведения исследуемой
сыворотки крови, предварительно обработанной
с целью удаления ингибиторов вирусов,
начиная от 1: IО, 1: 20, 1: 40, 1: 80 и до 1: 1280. для
разведения используют физиологический
раствор, содержащий 1%-й раствор нормальной
сыворотки крови кролика; рН 7,2. ..7,4. Объем
каждого разведения 0,5 мл. 2. К каждому разведению
сыворотки крови добавляют по 0,1 мл эритроцитарного
вируссодержащего антигена, смесь встряхивают
и оставляют при комнатной температуре
на З...5 ч (при классической чуме свиней
— на 40...60 мин). З. Результаты реакции учитывают
по наличию или отсутствию осадка эритроцитов
на дне пробирки или лунки. При положи
тельном значении реакции осадок склеенных
эритроцитов будет в виде раскрытого зонтика,
при отрицательном — плотный осадок в
виде маленького диска. За титр антител
в исследуемой сыворотке крови принимают
наибольшее ее разведение, вызывающее
агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.
4. Одновременно обязательно ставят следующие
контроли: 1) с сенсибилизированными эритроцитами
и физиологическим раствором на спонтанную
агглютинацию эритроцитарного вирусного
антигена. Результат — отрицательная
реакция; 2) с исследуемой сывороткой крови
и несенсибилизированными (нормальными)
эритроцитами на отсутствие в сыворотке
крови неспецифических гемагглютининов
(вирусов). Результат — отрицательная
реакция; З) с сенсибилизированными эритроцитами
и положительной сывороткой крови, содержащей
специфические противовирусные антитела,
на активность сенсибилизированных эритроцитов.
Результат — положительная реакция; 4)
с сенсибилизированными эритроцитами
и нормальной сывороткой крови, не содержащей
специфические противовирусные антитела,
на специфичность сенсибилизированных
эритроцитов. Результат — отрицательная
реакция. Методика и последовательность
постановка РНГА для обнаружения противовирусных
антител и определения их титра в исследуемой
сыворотке микроскопическим способом.
Для постановки реакции используют специальные
микропанели Такачи, автоматические пипетки
(многоканальные) с изменяющимся объемом.
1. Готовят двукратные разведения исследуемой
сыворотки крови физиологическим раствором,
содержащим 1 % сыворотки крови кролика,
начиная от 1:2, 1:4 до 1:256, следующим способом:
физраствор по 0,025мл -> следуемая сыворотка
крови 0,025 на каждое разведение). 2. К каждому
разведению исследуемой сыворотки крови
добавляют по 0,025 мл эритроцитарного вирусного
антигена, смесь встряхивают и оставляют
при комнатной температуре на 1...2 ч. З.
Результаты реакции учитывают по тем же
показателям, что и при макрометоде. Реакцию
оценивают в плюсах: — склеенные эритроциты
образуют осадок в виде перевернутого
зонтика с неровными краями; ++ — по краям
осадка из склеенных эритроцитов имеется
(намечается) тонкое кольцо из несклеенных
эритроцитов; + — по краям осадка из склеенных
эритроцитов располагается широкое кольцо
из несклеенных эритроцитов; — — эритроциты
оседают на дно в виде плотного диска (отрицательная
реакция). За титр исследуемой сыворотки
крови принимают наибольшее ее разведение,
которое еще вызывает гемагглютинацию
сенсибилизированных эритроцитов не менее
чем на два плюса (++). 4. Одновременно обязательно
ставят те же контроли, что и при макрометоде.
Их значения те же.
41. Метод иммуннофлуоресценции.
Реакция иммунофлуоресценции применяется
для экспресс-диагностики многих заболеваний,
в частности бешенства. Сущность метода:
мазки-отпечатки головного мозга обрабатываются
флюоресцирующим глобулином, содержащим
связанные с люминесцентной краской антитела
к вирусу бешенства . Если головной мозг
поражен вирусом бешенства, то антитела
связываются с антигеном вируса бешенства
и образовавшийся комплекс антиген-антитело-люминесцентная
краска имеет специфическое свечение.
Из каждого
отдела головного мозга (аммонова рога,
мозжечка, коры больших полушарий и продолговатого
мозга) готовят по два препарата - мазка-отпечатка.
Не допускаются
для исследования пробы, консервированные
глицерином, фиксированные этиловым спиртом,
формалином и другими средствами, вызывающими
денатурацию и разрушение антигенов или
создающими дополнительный ("свой")
фон свечения.
-Препараты
высушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном
ацетоне при плюс 4 или минус 12 С в течение
4-12 часов. Затем препараты извлекают из
ацетона, высушивают на воздухе 10-15 минут
и помещают их во влажную камеру (чашки
Петри с увлажненным дном).
-Диагностический
антирабический флуоресцирующий иммуноглобулин
(ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно
на всю поверхность препарата при помощи
пипетки (примерно 0,1мл на один препарат),
закрывают камеру с препаратами, помещают
в термостат и выдерживают 30 минут при
37 С. Затем предметные стекла с препаратом
троекратно промывают, погружая их каждый
раз на 10 минут в сосуд, наполненный фосфатным
буфером рН 7,4 , помывают дистиллированной
водой и высушивают на воздухе. На окрашенные
препараты наносят иммерсионное нефлуоресцирующее
масло.
-Подготовленне
препараты просматирвают под
люминесцентным микроскопом с
иммерсионной системой.
-При положительных
результатах исследования в препаратах,
содержащих антиген бешенства, обнаруживают
разной величины и формы ярко
светящиеся желто-зеленым светом гранулы
в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется
от едва заметных в виде песчинок образований
до 15-20 мм.
Не пораженная
вирусом бешенства мозговая нервная ткань
светится тусклым серовато-желтым или
зеленоватым светом.
42. Иммуноферментный анализ. Иммуноферментный метод основан
на взаимодействии антигена и антител,
где в качестве метки в конъюгате (комплекс
антитела или антигена с ферментом) используется
фермент пероксидаза или другие и соответствующая
им субстратная смесь (5-аминосалициловая
кислота и пероксид водорода или ортофенилендиамин
и пероксид водорода). По чувствительности
этот метод в 100 раз и более превышает РИГА,
РДП и др. Предел чувствительности иммуноферментного
метода достигает Юнг/мл специфического
белка.
Иммуноферментный
метод в вирусологии используют для выявления
и идентификации вируса и антител к нему.
Различают
две разновидности иммуноферментного
метода: гомогенный и гетерогенный. Гетерогенный
методе литературе описан под названием
иммуносорбентного — ELISA-теста и РЭМА
— реакции энзиммеченых антител (или антигенов),
адсорбированных на поверхности водонерастворимых
полимерных материалов. При гомогенном
иммуноферментном методе не используется
твердая фаза. Гомогенный иммуноферментный
метод в основном предназначен для определения
низкомолекулярных антигенов (гормонов,
лекарственных препаратов).
Для выполнения
твердофазного иммуноферментного метода
необходимы определенные компоненты.
1. Специфические
иммуноглобулины (выделяют из гипериммунной
сыворотки осажденным сульфатом аммония
с последующей очисткой).
2. Антивидовые
глобулины (выделяют из антивидовых
сывороток осажденным сульфатом
аммония с последующей очисткой).
3. Белок
А (выделяют из золотистого стафилококка)
или бычий сывороточный альбумин.
4. Антиген
(готовят из органов зараженных животных).
Заведомо положительные и отрицательные
антигены.
5. Фермент
пероксидаза (выделяют из хрена).
6. Конъюгаты
(пероксидаза, связанная с антителами
или антигеном методом периодатного
окисления).
7. Субстратная
смесь (5-аминосалициловая кислота и пероксид
водорода или ортофенилендиамин и пероксид
водорода).
8. Детергент
(поверхностно-активные вещества: твин-20,
-80, тритон х-100, сорбиталь с-20).
9. Иммунологический
планшет (планшет из прозрачного
полистирола).
10. Шприц-дозатор
(для разлива ингредиентов реакции). На
биофабриках и в лабораториях научно-исследовательских
институтов готовят диагностическое наборы.
Существуют
прямой и непрямой методы постановки этой
реакции. На практике в основном используют
непрямой метод.
Иммуноферментный
метод определения антигена. Перед постановкой
реакции лиофилизированные компоненты
растворяют в объеме, указанном на этикетке,
0,01 М раствором фосфатного буфера или
дистиллированной водой и доводят до объема
рабочих разведений. Объем компонентов,
вносимых поэтапно в лунки планшета составляет
0,1 мл.
Этапы постановки
реакции.
1. Сенсибилизация
планшета. В лунки планшета вносят
специфические антитела (иммуноглобулины)
в рабочем разведении, указанном
на этикетке. Планшет с антителами
инкубируют в термостате при 37 "С в течение
3 ч или при 4 "С в течение 18 ч. По окончании
инкубации проводят отмывку планшета
раствором фосфатного буфера, содержащим
твин, 3...4 раза предварительно встряхнув
содержимое лунок. Остатки раствора удаляют
постукиванием о фильтровальную бумагу.