Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

Преимуществами внутреннего  стандарта является подтверждение  достоверности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид – для флавоновых гликозидов, катехин – для флаван-3-олов, нарингенин – для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин – для дигидрофлавонолов, даидзеин – для изофлавонов [13,14].

Для количественного анализа  строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков [13,14].

На примере хроматографирования смеси флавонов и флавонолов в обращенно-фазном варианте (рисунок 1.5) показано, что порядок выхода флавоноидов коррелирует с числом гидроксильных групп, а именно: время удерживания возрастает по мере снижения числа гидроксильных групп в молекуле.

Хроматографические условия: колонка Sep-Pak C-18, градиентный режим: метанол – 5 мМ, H₃PO_4.

 

Рисунок 1.5  – Хроматограмма смеси флавоноидов

 

Описание пиков и времени  удерживания представлены в таблице 1.3.

 

Таблица 1.3 – Время удерживания  различных флавоноидов

Пики	Число ОН-групп	Время удерживания, мин
1 – мирицетин	1	11.5
2 – кверцетин	2	19.5
3 – лютеолин	3	23.0
4 – кемпферол	4	31.0
5 – апигенин	5	33.5

 

1.3 Количественное  и качественное определение флавоноидов

1.3.1 Химические  методы исследования флавоноидов

1.3.1.1 Методы  качественной идентификации флавоноидов

 

Для обнаружения различных  видов флавоноидов используются качественные реакции.  Они необходимы для подтверждения нахождения той  или иной структуры на этапе идентификации флавоноидов. Наиболее характерными реакциями являются следующие:

 

1. Цианидиновая проба (проба Шинода)

Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба (рисунок 1.6), проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы) [4]. 

 

Рисунок 1.6 – Цианидиновая проба

 

Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению окраски. При использовании  цинка положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.

Цианидиновую реакцию не обнаруживают халконы, ауроны, но при добавлении концентрированной соляной кислоты (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.

Для постановки реакции 1 г  порошка сырья заливают 10 мл 95% этанола, нагревают на водяной бане до кипения  и настаивают 3 – 4 ч. Спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до объема 2 мл, делят пополам и разливают  в 2 пробирки; в каждую пробирку прибавляют по 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. В 1-ю пробирку добавляют 0.03 – 0.05 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. Жидкость окрашивается в красный цвет. Во 2-й пробирке окрашивание отсутствует [4].

2. Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона-Таубека)

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы,  взаимодействуя с борной кислотой в присутствии лимонной (реактив Вильсона), образуют желтую окраску с красноватой флюоресценцией в УФ-свете. При замене лимонной кислоты на щавелевую (реактив Таубека) в УФ-свете отмечается зеленая или желтая флюоресценция (рисунок 1.7).

 

 

Рисунок 1.7 – Реакция Вильсона-Таубека

 

3.  Реакция с треххлористой сурьмой

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы,  взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или желто-оранжевый цвет – флавоны, в красный или красно-фиолетовый – халконы (рисунок 1.8).

 

 

Рисунок 1.8  – Реакция  с треххлористой сурьмой

 

Реакцией по Брианту (которая является модификацией пробы Шинода) можно отличить гликозиды от агликонов. Суть метода заключается в следующем: после проведения цианидиновой пробы к раствору добавляют октанол и взбалтывают. При наличии агликонов окраска переходит в органический слой.

 

4) Образование фенолятов

Так как в своей структуре  флавоноиды имеют фенольные гидроксилы, то им присущи химические свойства, соответствующие данной функциональной группе. Так, фенольные ОН-группы способны проявлять слабокислые свойства, образуя феноляты с основаниями.

 

5) Взаимодействие со щелочами

Характерной реакцией на флавоноиды считается также их взаимодействие с щелочами. Флавоны, флавонолы, флаваноны и флаванонолы растворяются в щелочах с образованием жёлтой окраски, которая при нагревании изменяется до оранжевой или коричневой. Халконы и ауроны при взаимодействии со щелочами обычно дают красное или ярко-жёлтое окрашивание.

 

6) Образование комплексов  с солями металлов

Присутствие фенольных гидроксилов  и карбонильной группы позволяет  флавоноидам образовывать комплексы  различной степени устойчивости с солями металлов (Аl³⁺, Fe³⁺, Pb²⁺ и так далее), вступать в реакции с диазосоединениями с образованием азокрасителей.

 

7) Диазотирование

При проведении реакции диазотирования азосочетание проходит по 6 или 8 положениям. Если положения 5 и 7 замещены, то реакция не идёт (можно доказать присутствие в 7 положении углеводного компонента). В качестве диазосоставляющего часто используют кислоту сульфаниловую или п-нитроанилин.

 

8) При использовании хроматографических методов определения флавоноидов их можно обнаружить на хроматограммах по флуоресценции или в виде окрашенных пятен при сканировании в УФ-свете или/и проявлении одним из реактивов (пары аммиака, 5 %-ный спиртовой раствор алюминия хлорида, 10 % раствор щёлочи, реактив Вильсона, раствор диазотированного сульфаниламида и другие) [4].

1.3.1.2 Объемные методы количественного определения флавоноидов

 

Объёмный анализ – это совокупность методов химического количественного анализа, основанного на измерении объёмов для установления концентрации (содержания) определяемого вещества. К объёмным методам анализа относят распространённые в лабораторной практике различные варианты титриметрического анализа, основанного на измерении объёма израсходованного раствора реагента известной концентрации, необходимого для достижения точки эквивалентности.

Комплексонометрия – метод  титриметрического анализа, который  основан  на образовании прочных комплексных соединений ионов металлов (всех, кроме одновалентных) с комплексоном III (двунатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты), при этом изменяются концентрации ионов металлов в титруемом растворе.

Метод комплексонометрического титрования избытка ацетата свинца, не вступившего в реакцию осаждения с флавонолами, обладает достаточной избирательностью по отношению к флавоноидам и позволяет проводить определение флавонолов в присутствии ацетилсалициловой кислоты, антрахинонов, кумаринов.

К титриметрическому методу анализа также относится  метод  окисления флавоноидов ферроцианидом калия по n-фенил-аптрониловой кислоте. Однако метод длителен и не обладает избирательностью [10].

1.3.2  Электрохимические  методы исследования флавоноидов

1.3.2.1 Потенциометрический  метод количественного определения  флавоноидов

 

Потенциометрическое титрование относится к методу электрохимического анализа, основанному на измерении изменяющегося в процессе титрования электрохимического потенциала электрода, погруженного в изучаемый раствор.

Количественное определение  флавоноидов в среде неводных растворителей, например, ацетона, диметилформамида, диметилсульфоксида потенциометрическим методом возможно с использованием в качестве титрантов гидроокиси тетраэтиламмония или натрия. Метод имеет преимущество перед оптическими в точности определения и не требует наличия стандартных веществ для проведения количественной оценки.

Малая чувствительность (для  анализа требуется 0.0005 – 0.001 г вещества) и недостаточная селективность  для каждого из классов затрудняют определение без предварительного разделения веществ в сырье и суммарных препаратах [15].

1.3.2.2 Полярографические методы количественного определения флавоноидов

 

В основу высокочувствительного  полярографического метода анализа положено восстановление флавоноидов на ртутном капельном электроде. Метод позволяет анализировать сумму флавоноидов, в пересчете на одно из соединений, выбранное в качестве стандарта. В отличие от спектрофотометрии окрашенных комплексов метод дает более близкие к истинному суммарному содержанию результаты для флавоноидов.

Флавоноиды (флавонолы) могут быть определены на фоне 0.4 М раствора хлористого аммония при потенциале полуволны 1.5 В. Полярографический метод позволяет устанавливать наличие внутримолекулярных связей, проводить идентификацию по величине потенциала полуволны, оценивать реакционную способность отдельных групп в молекуле. В практике фармацевтического анализа и в особенности в заводских условиях полярографический анализ встречает затруднения, так как требует соблюдения строгих условий техники безопасности при работе со ртутью. К недостаткам метода можно отнести его малую избирательность из-за близких величин потенциалов полуволн, в связи, с чем требуется, как и при спектральных методах, предварительное разделение веществ [16].

1.3.2.3 Метод капиллярного  электрофореза

 

В современной науке для  обнаружения и количественного  определения флавоноидов в растительном сырье также используется метод  капиллярного электрофореза [17].

Метод капиллярного электрофореза  основан на разделении компонентов  сложной смеси в кварцевом  капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером  – электролитом. После подачи к  концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее – величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. На рисунке 1.9  показана схема установки для капиллярного электрофореза [18].

 

 

Рисунок 1.9  –  Схема установки для капиллярного электрофореза

 

На заряженную частицу  в простейшем случае действуют две  противоположно направленные силы –  электростатического притяжения и  сопротивления движению частицы. В  равновесных условиях действие этих сил уравновешивает друг друга, и  скорость миграции частицы определяется выражением:

 

,

(1.1)

 

где, q – заряд иона;

E – напряженность электрического поля;

η – вязкость среды;

r – радиус частицы.

Электрофоретическая подвижность  μ_эф определяется как скорость движения частицы, деленная на напряженность электрического поля:

 

,

(1.2)

 

где, V_эф – скорость идеализированной сферической частицы.

 

При проведении разделения в капиллярах особенно важное значение приобретает электроосмотический поток (ЭОП), связанный с движением диффузной части двойного слоя, образующегося относительно заряженной поверхности внутренней стенки капилляра (рисунок 1.10).

 

 

Рисунок 1.10 –  Схема возникновения ЭОП

 

Заряд поверхности определяется наличием отрицательно заряженных силанольных групп на поверхности немодифицированных кварцевых капилляров или создается за счет дополнительной модификации поверхности.