Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

2.3.1 Определение влажности

 

Для определения влажности  проводили два параллельных определения  на содержание влаги в растительном сырье по методике, указанной в  п. 2.2.2.  Для этого берут по две  точные навески (около 5 г) каждой пробы. Отбор проб производился согласно ГОСТ 24027.0-80 «Правила приемки и метода отбора проб».  В сушильном шкафу  при температуре 100-105⁰С навески были доведены до постоянной массы. После проведения испытаний и расчетов, указанных в п. 2.2.2 получены следующие результаты, приведенные в таблице 2.3.

 

 

 

 

 

Таблица 2.3 – Содержание влаги в пробах лекарственного растительного  сырья

№ пробы	Масса пробы до высушивания	Масса пробы после высушивания	Содержание влаги, %	Среднее значение содержания влаги, %
Проба 1 Навеска 1 Навеска 2	5.0137 5.0073	4.5976 4.5817	8.30 8.50	8.40
Проба 2 Навеска 1 Навеска 2	5.0203 5.0508	4.4329 4.4498	11.70 11.90	11.8
Проба 3 Навеска 1 Навеска 2	5.0196 5.0068	4.4925 4.4661	10.50 10.80	10.70

 

На основании проведенных  исследований можно сделать вывод  о том, что во всех пробах лекарственного растительного сырья содержание влаги соответствует ГФ 11 (содержание влаги для травы пустырника должно быть не более 13%, а для цветков  календулы и плодов боярышника –  не более 14%).

2.3.2 Количественное определение суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом при оптимальных условиях экстрагирования

В ходе исследования было выявлено, что наиболее полное извлечение определяемых веществ достигалось с использованием 70%-го спирта этилового, временем экстрагирования 2 ч и при температуре проведения эксперимента 60 °С. При определении количественного содержания флавоноидов лекарственного растительного сырья в пересчете на рутин, были получены данные, представленные в таблице 2.4. Эксперимент проводился согласно методике, представленной в п. 2.2.3.

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2.4 – Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в растительном сырье

Наименование экстракта	Содержание флавоноидов  в пересчете на рутин, мг/мл
Экстракт травы пустырника	0.0055
Экстракт цветков календулы	0.0053
Экстракт плодов боярышника	0.0015

2.3.3 Количественное  определение флавоноидов в лекарственном  растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

 

Метод количественного анализа  основан на комбинации двух самостоятельных  методов – хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго – идентификацию и количественный анализ. Перед количественным определением содержания кверцетина и рутина в исследуемых образцах экстрактов растительного сырья, необходимо построение градуировочного графика с использованием ГСО анализируемых биофлавоноидов. Градуировочный график в координатах площадь пика – концентрация должен быть линеен и прямая должна проходить через начало координат. Для построения такого графика достаточно, вообще одной экспериментальной усредненной точки. Однако градуировочный график обычно строят не менее чем по 3-8  средним точкам, полученным в результате 3-х последовательных измерений, что повышает точность и надежность определений. Для построения калибровочного графика используют аликвоты  растворов рутина  и кверцетина равные 0.2 см³. Далее путем последовательного разбавления 70% этиловым спиртом получают растворы с концентрацией, указанной в таблице 2.5, 2.6 для рутина и кверцетина, соответственно.

Для построения калибровочной кривой методом последовательного разбавления была приготовлена серия растворов каждого исследуемого биофлавоноида. Затем анализируемые образцы помещали в виалки и последовательно располагали в автоматическом пробоотборнике. Далее с использованием программного обеспечения прибора задавали условия проведения анализа, указанные в п. 2.2.4.

Данные для построения калибровочных кривых для рутина и кверцетина, представлены в таблице 2.5, 2.6, соответсвенно:

 

 

 

Таблица 2.5 – Данные для построения калибровочных кривых для рутина и кверцетина

Концентрация раствора, мг/мл	Площадь пика.10-6 (рутин), импульсы	Площадь пика.10-6 (кверцетин), импульсы
0.0001	0.0664	0.808
0.0002	0.0657	1.060
0.0005	0.4150	3.890
0.001	2.3200	17.10
0.002	0.5690	6.090
0.02	2.1900	25.800
0.05	6.2500	56.600
0.1	7.0000	97.500

 

На основании полученных данных были построены калибровочные  графики, на которых показана зависимость  площади пика от концентрации рутина и кверцетина. Построение графика  производилось с помощью программы  SigmaPlot 11. Полученные зависимости приведены на рисунке 2.2 для рутина и на рисунке 2.3 для кверцетина.

 

 

Рисунок 2.2 – График зависимости площади пика от концентрации рутина

Следует отметить, что кривая, описывающая зависимость площади пика от концентрации рутина имеет область линейности и область полного насыщения детектора. Отклонение от линейности связано с увеличением концентрации анализируемого вещества.

 

Рисунок 2.3 – График зависимости площади пика от концентрации кверцетина

 

По разработанной методике, указанной в п. 2.2.3 раздела подготовка к анализу, получены экстракты травы пустырника сердечного, цветков календулы и плодов боярышника. Далее был проведен хроматомасспектрометрический анализ биофлавоноидов (рутина и кверцетина) в исследуемых образцах. Результаты, полученные в ходе анализа представлены в таблице 2.7 для рутина и в таблице 2.8 для кверцетина.

 

Таблица 2.7 – Площадь пика для рутина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Площадь пика .10-6, импульс	Средняя площадь пика 10-6, импульсы
1	2	3
Экстракт травы пустырника	0.0784	0.07790
	0.0771
	0.0783

 

Продолжение таблицы 2.7

1	2	3
Экстракт цветков календулы	0.0359	0.03590
	0.0360
	0.0358
Экстракт плодов боярышника	0.00260	0.00264
	0.00268
	0.00264

 

 

Таблица 2.8 – Площадь пика для кверцетина в исследуемых  экстрактах

Наименование экстракта	Площадь пика .10-6, импульс	Средняя площадь пика 10-6, импульсы
Экстракт травы пустырника	0.00546	0.00546
	0.00544
	0.00547
Экстракт цветков календулы	0.00192	0.00193
	0.00199
	0.00188
Экстракт плодов боярышника	0.0172	0.01540
	0.0121
	0.0168

 

 

На основании полученных данных, с использованием градуировочных графиков для рутина (рисунок 2.1) и кверцетина (рисунок 2.2), определи количественное содержание исследуемых биофлавоноидов в экстрактах растительного сырья. Результаты количественного содержания рутина и кверцетина представлены в таблице 2.9 и 2.10, соответственно. Для расчетов использовали данные средних площадей пиков для рутина и кверцетина в анализируемых экстрактах.

 

 

 

 

 

 

Таблица 2.9 – Содержание рутина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Содержание рутина .10-3, мг/мл
Экстракт травы пустырника	0.1900
Экстракт цветков календулы	0.0353
Экстракт плодов боярышника	0.0097

 

Таблица 2.10 – Содержание кверцетина в исследуемых экстрактах

Наименование экстракта	Содержание кверцетина .10-3, мг/мл
Экстракт травы пустырника	0.0051
Экстракт цветков календулы	0.0014
Экстракт плодов боярышника	0.0140

 

На основании полученных данных (таблица 2.4 и 2.9) было проведено сравнение количественного содержания рутина в анализируемых экстрактах. На рисунке 2.3 представлено сравнение содержания рутина в экстрактах растительного сырья по данным, полученным на основании спектрофотометрического и хроматомасспектрометрического анализа.

 

Рисунок 2.4 – Сравнение спектрофотометрического и хроматомасспектрометического методов

 

Из представленных данных очевидно, что спектрофотометрический метод определения биофлавоноидов показывает завышенное содержание рутина по сравнению с результатами хроматомасспектрометрического анализа. Это связано с тем, что спектрофотометрический метод позволяет оценить только суммарное содержание флавоноидов в экстрактах, так как максимумы поглощения родственных соединений располагаются в одной области (например, 408-420 нм для рутина, морин, кемпферол, гиперазид и др.). Поэтому данные спектрофотометрического анализа всегда пересчитывается на тот или иной флавоноид (чаще всего рутин).

Таким образом, спектрофотометрия не дает возможности проводить, наряду с количественным, качественный анализ биофлавоноидов и оценить реальное содержание исследуемого флавоноида в лекарственном растительном сырье. Этот недостаток устраняется при использовании хроматомасспектрометрического метода анализа, который позволяет идентифицировать отдельные флавоноиды независимо от присутствия посторонних и/или родственных соединений.

 

3 ЭКОНОМИЧЕСКАЯ  ЧАСТЬ

Введение

 

Фармацевтический рынок  является одним из прибыльных и быстро растущих секторов экономики развитых стран. Это обусловлено тем, что  создание, производство и применение лекарств тесно связаны с такой общечеловеческой ценностью как здоровье. Для изготовления лекарственных препаратов, наряду использования синтетических компонентов, используют лекарственное растительное сырье.

В начале прошлого века бурный прогресс в области создания лекарств синтетического происхождения стал теснить лекарственные растения, как в лечебной, так и в профилактической практике. Однако в последние десятилетия  интерес к лечебно-профилактическим средствам природного происхождения (фитопрепаратам) возродился и развивается с нарастающим темпом. Основным фактором повышения интереса к лечебным свойствам лекарственных растений явилось то, что значительной части синтетических сильнодействующих препаратов присущи различные нежелательные, даже опасные побочные эффекты. Особенно чувствительны к нежелательным эффектам синтетических лекарств люди пожилого возраста, больные хроническими заболеваниями и дети.

Наиболее привлекательными чертами фитопрепаратов являются: возможность длительного применения, высокая безопасность при достаточной эффективности, простота приготовления и применения. По мнению экспертов, одним из основных факторов, сдерживающих развитие фитотерапии и ее внедрение в практику, выступает недостаточный уровень образования, информированности об этом методе врачей и провизоров.

Для российского рынка  лекарственных трав и сборов в  настоящее время характерна тенденция к росту. Однако объем рынка и его доля в общем объеме рынка фармпрепаратов на сегодняшний день выглядят довольно скромно, составляя 11-12 млн. долларов США или 0.5-1.5%. В странах же Евросоюза аналогичная продукция занимает до 10% от общего объема лекарственного рынка (рисунок 4.1).

Оценивая современные тенденции развития российского рынка лекарственных средств и сборов, эксперты полагают, что, несмотря на довольно скромные объемы, он представляет весьма перспективный сегмент российского фармацевтического рынка. В настоящее время интерес к фитопрепаратам проявляет целый ряд компаний. Со стороны потенциальных производителей интерес к лекарственным травам во многом стимулируется относительно небольшими размерами необходимых инвестиций. Так, при организации производства по переработке лекарственных трав и сборов основная часть средств требуется на фасовочное оборудование и составляет порядка 10 тыс. долларов США. Помимо этого для производства фитопродукции требуется разрешение Министерства здравоохранения и помещение для его размещения. В технологическом плане производство лекарственных трав и сборов является несложным, продукция не облагается НДС и налогом на прибыль.