Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 26 Апреля 2013 в 12:12, дипломная работа

Краткое описание

Целью дипломной работы является разработка методики качественного и количественного анализа природных флавоноидов (рутина и кверцетина) с использованием спектрофотометрического и хроматомасспектрометрического методов.
Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:
выявить необходимость качественного и количественного анализа биофлавоноидов;
выявить особенности (строение, физические и химические свойства) природных флавоноидов как объектов исследования;
проанализировать содержание рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье;
изучить современные методы выделения и идентификации флавоноидов;
изучить теоретические вопросы анализа методами спектрофотометрии и хроматомасспектрометрии;

Содержание

Введение 8
1 Общая часть 10
1.1 Краткая характеристика флавоноидов 10
1.2 Подготовка растительного сырья, идентификация, выделение и разделение флавоноидов 14
1.2.1 Сушка растительного сырья 14
1.2.2 Первичное исследование растительного сырья 15
1.2.3 Экстрагирование флавоноидов из растительного сырья 17
1.2.4 Хроматографические методы идентификации флавоноидов 18
1.2.4.1 Тонкослойная хроматография 18
1.2.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 20
1.3 Количественное и качественное определение флавоноидов 22
1.3.1 Химические методы исследования флавоноидов 22
1.3.1.1 Методы качественной идентификации флавоноидов 22
1.3.1.2 Объемные методы количественного определения флавоноидов 26
1.3.2 Электрохимические методы исследования флавоноидов 26
1.3.2.1 Потенциометрический метод количественного определения флавоноидов 26
1.3.2.2 Полярографические методы количественного определения флавоноидов 27
1.3.2.3 Метод капиллярного электрофореза 27
1.3.3 Физико-химические методы исследования флавоноидов 31
1.3.3.1 Оптические методы определения флавоноидов 31
1.3.3.2 Абсорбционная спектроскопия 34
1.3.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов 45
1.3.4.1 Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов 45
2 Специальная часть 50
2.1 Выбор объекта исследования 50
2.1.1 Характеристика исследуемого сырья 50
2.1.1.1 Цветки календулы 50
2.1.1.2 Трава пустырника 51
2.1.1.3 Плоды боярышника 51
2.2 Методики экспериментов и анализов 52
2.2.1 Методы отбора проб 52
2.2.2 Метод определения влажности лекарственного растительного сырья 53
2.2.3 Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом 54
2.2.4 Количественное определение рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии 57
2.2.5 Использованные реагенты 60
2.3 Результаты и обсуждение 61
2.3.1 Определение влажности 61
2.3.2 Количественное определение суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом при оптимальных условиях экстрагирования 62
2.3.3 Количественное определение флавоноидов в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии 63
3 Экономическая часть 69
Введение 69
3.1 Определение затрат на проведение исследования 74
3.1.1 Материальные затраты 74
3.1.2 Затраты на израсходованную электроэнергию 75
3.1.3 Заработная плата исполнителей исследования 76
3.1.4 Амортизационные отчисления 76
3.1.5 Расчет отчислений в социальные фонды 77
3.1.6 Определение накладных расходов 78
3.1.7 Смета затрат 78
Заключение 79
4 Безопасность и экологичность 80
4.1 Идентификация опасных и вредных факторов при работе в химической лаборатории 80
4.1.1 Основные понятия и гигиенические требования к производственному освещению 81
4.1.2 Влияние вибрации на условия труда в химической лаборатории 82
4.1.3 Влияние шума на организм человека 82
4.1.4 Вредные вещества в воздухе рабочей зоны и их воздействие на организм человека 83
4.2 Техника безопасности при работе в химической лаборатории 85
4.2.1 Общие требования безопасности при работе в лаборатории 85
4.2.2 Требования охраны труда перед началом работы 86
4.2.3 Требования охраны труда во время работы 86
4.2.4 Требования охраны труда по окончании работы 88
4.3 Общие положения по технике безопасности при использовании электроустановок в лаборатории 89
4.4 Эксплуатация электроприборов 89
4.5 Требования охраны труда в аварийных ситуациях 90
4.5.1 Общие требования безопасности в аварийных ситуациях 90
4.5.2 Требования безопасности в аварийных ситуациях при использовании электроустановок в лаборатории 91
4.5.3 Первая помощь пострадавшим от электрического тока 91
4.5.4 Требования безопасности в аварийных ситуациях при возникновении пожара в лаборатории 92
4.5.5 Действия по оказанию первой помощи пострадавшим 93
4.6 Экологичность эксперимента 94
4.7 Расчет осветительной установки для учебно-аналитической лаборатории 95
Заключение 100
Список использованных источников 101

Скачать в ZIP архиве (1.66 Мб) Сколько стоит заказать работу?
Вложенные файлы: 1 файл

Весь Диплом.docx

— 1.69 Мб (Скачать файл)

Важное условие работы прибора – быстрая запись масс-спектра, который должен регистрироваться за время, гораздо меньшее, чем время  выхода хроматографического пика. Медленная  запись масс-спектра может исказить соотношение интенсивностей пиков  в нем. Скорость регистрации масс-спектра (скорость сканирования) определяется масс-анализатором. Наименьшее время сканирования полного масс-спектра (несколько миллисекунд) обеспечивает квадрупольный анализатор. В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс – время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы.  
Как описано выше, может быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочих температур колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя. Если вещества не удовлетворяют этим требованиям, их можно химически модифицировать, например силилированием, алкилированием или ацилированием гидрокси-, карбокси-, меркапто-, аминогрупп.

Чувствительность хроматомасспетрометрии (обычно 10-6-10-9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10-12-10-15 г) разновидность хроматомасспетрометрии – массфрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хроматомасспетрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например  при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия). Осуществляют масс-фрагментографию на хромато-масс-спектрометрах с использованием специального устройства – многоионного детектора либо с помощью ЭВМ, которая может строить хроматограммы по одному или нескольким ионам. Такая хроматограмма, в отличие от обычной, содержит пики лишь тех компонентов, в масс-спектрах которых есть такие ионы. Анализ проводят с применением внутреннего стандарта, в качестве которого часто используют аналог искомого вещества, меченный стабильными изотопами (2Н, 13С, 15N, 18O).

Другой вариант хроматомасспетрометрии заключается в сочетании ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖХ. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0.5-5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически.

В ряде промышленных приборов реализован принцип ленточного транспортера. Элюат из колонки попадает на движущуюся ленту, которая проходит через обогреваемую ИК излучением камеру, где испаряется растворитель. Затем лента с веществом проходит через область, обогреваемую другим нагревателем, где испаряется анализируемое вещество, после чего оно поступает в ионный источник и ионизируется. Более эффективный способ сочетания высокоэффективного газо-жидкостного хроматографа и масс-спектрометра основан на электро- и термораспылении. В этом случае элюат пропускают через капилляр, нагретый до 150 °С, и распыляют в вакуумную камеру. Ионы буфера, присутствующие в растворе, участвуют в ионоооразовании. Образовавшиеся капли несут положительный, или отрицательный заряд. Вдоль капли из-за малого ее диаметра создается высокий градиент электрического поля, причем по мере распада капель этот градиент возрастает. При этом происходит десорбция из капель протонированных молекулярных  ионов или кластеров (молекула вещества + катион буфера).

Метод хроматомасспетрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и других областях [16,20].

 

 

2 СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Выбор объекта исследования

 

В комплексной дипломной  работе были проанализированы литературные данные, на основании которых было выбрано сырье, содержащее наибольшее количество исследуемых флавоноидов (рутина и кверцетина): цветки календулы, трава пустырника, плоды боярышника.

2.1.1 Характеристика исследуемого сырья

2.1.1.1 Цветки календулы

Календула лекарственная (Calendula officinalis) или ноготки – однолетнее растение, род растений семейства сложноцветных. Полукустарники, многолетние или однолетние травы с ветвистыми стеблями и цельными листьями. Соцветия – корзинки на длинных цветоносах, одиночные; язычковые цветки многочисленные – жёлтые, пестичные и плодущие; трубчатые – обоеполые, но бесплодные; семянки изогнутые (до кольцевидных), наружные по форме отличаются от средних и внутренних.

В медицинских целях используют цветки и листья, без нижних частей стебля. Собирают цельные цветочные  корзинки или одни цветки. Собранное  сырье сушат, раскладывая на бумаге в помещениях или на воздухе под  навесом.

Помимо флавоноидов, календула  содержит эфирное масло, горькие  вещества, фитонциды, сапонины, слизи, большое количество каротина, органические кислоты, следы алколоидов.

Календула успокаивает нервную  систему, несколько снижает артериальное давление, усиливает работу сердечной  мышцы, замедляет сердечный ритм, уменьшает отеки. При применении внутрь препараты календулы проявляют  свою противовоспалительную активность, способствуют восстановлению слизистой  оболочки желудка и кишечника, заживлению язв и эрозий.

Настой календулы применяется  при неврозах, гипертонии, болях  в сердце (стенокардии), атеросклерозе  и в климактерическом периоде.

Календула также используется при лечении мочекаменной болезни  и циститах. Но особенно широко календула  применяется наружно при заболеваниях ротовой полости и глотки, при ранениях, ссадинах и трофических язвах, для спринцевания в гинекологической практике, для лечения воспалительных глазных заболеваний [21].

2.1.1.2 Трава пустырника

 

Пустырник обыкновенный (Leonurus cardiaca) – многолетнее травянистое растение семейства губоцветных. Стебель прямостоячий четырехгранный, высотой от 30 до 120 см. Листья супротивные, нижние округлые; средние – продолговатые или ланцетные, трехраздельные; верхние – узкие, цельные. Цветки розово-фиолетовые, собраны густыми мутовками в пазухах верхних листьев, образуя длинное прерывистое колосовидное соцветие на конце стебля.

По химическому составу  в пустырнике обыкновенном содержится монурин (горькое вещество), эфирное масло, дубильные вещества, группа алкалоидов (стахидрин, бетоницин, турицин, леондрин), флавоноиды, холин, гликозид, органические кислоты, аскорбиновая кислота, жирное масло.

Препараты пустырника обладают успокаивающим и антиконвульсионным действием на центральную нервную систему и применяются при неврозах. Настои используются при лечении в климактерический период и как вспомогательное средство при лечении базедовой болезни. Применение препаратов пустырника успокаивает работу сердца, увеличивает силу сердечных сокращений, снижает артериальное давление благодаря чему они применяются при гипертонии, сердечных неврозах, стенокардии, микрокардиопатии, кардиосклерозе [21].

2.1.1.3 Плоды боярышника

 

Боярышник кроваво-красный (обыкновенный) (Crataegus oxyacantha) относится к семейству розоцветных.

Плоды боярышника яблокообразные, от шаровидной до эллипсоидальной формы, твердые, морщинистые, длиной 6-14 мм, шириной 5-11 мм, сверху с кольцевой оторочкой, образованной ссохшимися чашелистиками. Цвет плодов от желто-оранжевого и буровато-красного до темно-бурого или черного, иногда с беловатым налетом выкристаллизовавшегося сахара. Запах отсутствует. Вкус сладковатый.

По химическому составу  плоды боярышника содержат флавоноиды, органические кислоты (лимонная, олеаноловая, урсоловая, кратегусовая, кофейная, хлорогеновая), каротиноиды, дубильные вещества, жирные масла, пектины, тритерпеновые и флавоновые гликозиды, β-ситостерин, холин, сахара, витамины и другие соединения.

Препараты на основе боярышника тонизируют работу сердца, усиливают  сердечные сокращения, нормализуют  артериальное давление, обладают спазмолитическим и успокаивающим действием, нормализуют  работу сердца. При их употреблении наступает глубокий и спокойный  сон. Усиление и ослабление действия препаратов зависит от их дозировки. Любые производные боярышника не токсичны и не вызывают побочных явлений. Чаще всего их используют при коронарной недостаточности с симптомами стенокардии, а также гипертонической болезни, атеросклерозе, повышенной возбудимости, потере сознания, острой форме суставного ревматизма. Настои цветков и плодов помогают при климактерических неврозах [21].

2.2 Методики экспериментов и анализов

2.2.1 Методы отбора проб

 

Метод отбора проб цветков  календулы лекарственной, травы  пустырника обыкновенного и плодов боярышника кроваво-красного производится согласно ГОСТ 24027.0-80 «Правила приемки  и методы отбора проб».

1) Подготовка к отбору  проб.

Попавшие в выборку  единицы продукции вскрывают  и, путем внешнего осмотра, определяют:

- однородность сырья по способу подготовки (цельное, измельченное, прессованное и т.д.), цвету, запаху и засоренности;

- наличие плесени, гнили,  устойчивого постороннего запаха, не исчезающего при проветривании;  засоренность ядовитыми растениями  и посторонними примесями (камни,  стекло, помет грызунов и птиц  и т.д.).

2) Измельчение. 

Сырье измельчают в фарфоровой ступке до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

  1. Отбор аналитических проб для определения влажности и содержания флавоноидов.

Аналитические пробы определяют методом квартования. Для этого сырье помещают на гладкую, чистую, ровную поверхность, перемешивают, разравнивают, по возможности тонким, равномерным по толщине слоем в виде квадрата, и по диагонали делят на четыре треугольника. Два противоположных треугольника удаляют, а два оставшихся соединяют, осторожно перемешивают, разравнивают в виде квадрата, вновь делят по диагонали и удаляют следующие два треугольника. Так повторяют до тех пор, пока в двух противоположных треугольниках не останется количество сырья, соответствующее массе аналитической пробы (5 г).

Аналитические пробы должны быть отобраны с погрешностью не более 0.01г [22].

2.2.2 Метод определения влажности лекарственного растительного сырья

 

Определение влажности растительного  сырья производится согласно ГОСТ 24027.2-80 «Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных веществ, эфирного масла». Основан данный метод на определении потери в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ при высушивании сырья до абсолютно сухого состояния [23].

 

Оборудование, материалы и реактивы:

  • шкаф сушильный лабораторный;
  • весы лабораторные;
  • весы аналитические;
  • эксикатор;
  • тигли;
  • щипцы тигельные;
  • вазелин технический;
  • концентрированная серная кислота.

 

  1. Подготовка к испытанию.

Берут две навески (аналитические пробы) сырья массой по 3-5 г (точная навеска), взвешенные с погрешностью не более 0.01 г. Каждую навеску помещают в предварительно взвешенный и пронумерованный тигель.

  1. Проведение анализа.

В сушильный шкаф, нагретый до 100-105 °С, быстро помещают подготовленные тигли с навесками. При этом температура в шкафу падает. Время, в течение которого сырье должно сушиться, отсчитывается с момента, когда температура в шкафу достигает  
100-105 °С. Высушивание проводят до постоянной массы.

Постоянная масса считается  достигнутой, если разница между  двумя последующими взвешиваниями  после 30 мин высушивания и 30 мин  охлаждения в эксикаторе не превышает 0.01 г.

Первое взвешивание семян и плодов проводят через 3 часа, а трав и цветков – через 2 часа. Тигли с навесками вынимают из шкафа тигельными щипцами и помещают на  
30 мин для охлаждения в эксикатор, на дне которого находится концентрированная серная кислота. Охлажденные тигли взвешивают[23].

Проводят два параллельных определения.

Влажность сырья (Х) в процентах  вычисляют по формуле (2.1).

 

(2.1)


 

где, m – масса сырья до высушивания, г;

m1 – масса сырья после высушивания, г.

 

Допускаемое расхождение  между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0.5%.

Информация о работе Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье