Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

Результирующая подвижность  частиц μ определяется суммой электрофоретической  и электроосмотической подвижностей:

 

,

(1.3)

 

где, – электрофоретическая подвижность;

 – электроосмотическая  подвижность.

 

Это дает определенные преимущества при анализе смесей противоположено  заряженных ионов, поскольку все  определяемые компоненты будут двигаться  в направлении детектора вследствие ЭОП.  Однако скорость передвижения ионов с одинаковым направлением электрофоретической и электроосмотической  подвижностей будет увеличиваться, а противоположенным – уменьшаться. Для немодифицированного кварцевого капилляра в диффузной части двойного электирического слоя присутствует некоторая избыточная концентрация катионов, в результате движения которых возникает ЭОП, направленный к катоду. В результате катионы будут перемещаться быстрее и детектироваться до ЭОП, а анионы медленнее и детектироваться после ЭОП, нейтральные молекулы движутся с ЭОП.

Для повышения воспроизводимости капиллярного электрофореза в присутствии ЭОП, электроосмотический поток должен быть постоянным в течение всех проводимых определений, а сохранение постоянства ЭОП часто требует значительных усилий по подготовке до и после работы. В кварцевых капиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролита и добавлении органических растворителей и возрастает с увеличением рН, а также зависит от вязкости раствора в капилляре и температуры. Если же при добавлении катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) к разделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируется положительный заряд (рисунок 1.11), то ЭОП меняет направление и переносит разделительный буфер в направлении анода.

 

 

Рисунок 1.11 – Изменение направления электроосмотического потока при модификации кварцевого капилляра катионными поверхностно-активными веществами

 

Уникальной особенностью ЭОП является плоский профиль  потока в капилляре. Такой профиль  выгоден, поскольку уменьшается  размывание зон разделяемых веществ. Следует отметить, что эффективность  разделения в капиллярном электрофорезе  прямо пропорциональна, а время  анализа – обратно пропорционально  напряжению, приложенному к электродам.

Разделение в капиллярном  электрофорезе может быть выполнено  как с положительной, так и  отрицательной полярностью электродов. Зная значения рКа для компонентов пробы, можно выбрать буфер с подходящим значением рН и полярность электродов, чтобы образец двигался в сторону детектора.

Скорость миграции зависит  от напряженности электрического поля, которая обычно составляет 200 – 400 В/см [18,15].

Преимуществами капиллярного электрофореза являются: высокая  эффективность разделения, экономичность (малый расход реактивов) и экспрессивность.

1.3.3 Физико-химические  методы исследования флавоноидов

1.3.3.1 Оптические  методы определения флавоноидов

 

Спектрофотометрический  и фотоколориметрический анализы  являются разновидностями молекулярно-абсорбционного спектрального анализа. Сущность молекулярно-абсорбционного спектрального анализа заключается  в качественном и количественном определении веществ по их спектрам поглощения. Физической основой спектрального  анализа является взаимодействие электромагнитного  излучения с веществом.

Основной закон спектрофотометрии - закон Бугера-Ламберта-Бера. Применительно к растворам его запись выглядит следующим образом:

 

,

(1.4)

 

где, 10 – начальная интенсивность  светового потока,

I - интенсивность светового пучка после прохождения раствора,

ε – коэффициент поглощения (экстинкции) светового потока,

С – концентрация вещества в растворе в моль/л,

l – толщина слоя светопоглощающего раствора.

 

 Из  уравнения (1.4) следует:

 

,

(1.5)

 

Величина lg (I₀/I) называется оптической плотностью раствора и обозначается символом D. Из (1.5) имеем:

 

(1.6)

 

Из уравнения (1.6) следует, что оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации светопоглощающего вещества в растворе и толщине слоя раствора. То есть при определённой толщине слоя раствора, оптическая плотность будет тем больше, чем больше концентрация вещества в растворе. Отсюда следует, что, определяя оптическую плотность раствора, мы можем напрямую определять концентрацию вещества в растворе. Увеличивая толщину слоя l можно измерять очень малые концентрации веществ [10,19].

Количественное определение  исследуемых флавоноидных соединении в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое  определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотомерии является одним из наиболее распространенных методов анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов – 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой «площади» вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет  
± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %. Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о их количестве.

Спектрофотометрические  или фотометрические определения по реакции диазотирования  ранее были широко распространены в анализе. Реакция чувствительна, но не избирательна, так как наряду с флавоноидами эту реакцию дают фенольные соединения, пиразолоны и другие классы соединений. Применение данного метода ограничено неспецифичностью его и внутри каждого из классов соединении из-за прохождения реакции у флавоноидов только по кольцу А при наличии свободного ортоположения по отношению к фенольному гидроксилу у 7-го углеродного атома. Поэтому даже суммарные определения с данным реактивом не показывают истинного содержания исследуемых веществ как в суммарных фитохимических препаратах, так и в растительном сырье.

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотнокислым галлием. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением азотнокислого галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония – 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием – 1-2 мкг.

Описаны методики анализа  флавоноидов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при  длине волны 575 нм, а также с цинком и мышьяком. Получить истинное суммарное содержание флавоноидов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у соединений одинакового количества комплексообразующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными   реактивами.

Несмотря на указанные  недостатки, метод нашел широкое применение при установлении суммарного содержания флавоноидов в сырье и суммарных фитохимических препаратах. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды.

Широко распространена при  определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции  комплексобразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексобразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как агликоны, так и гликозиды флавонов, флавонолов, халконов. Рабочая концентрация растворов 1-10 мкг/мл. Относительная ошибка определения ± 3.35 %.

Одним из методов определения  флавоноидных соединений по оптической плотности является также анализ продуктов взаимодействия с 4-аминоантипириновым реактивом. Однако, данный анализ требует соблюдения ряда условий, как и при реакции диазотировання, и не является избирательным.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Комплексонообразующие свойства флавоноидов положены в основу флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствительным, чем спектрофотометрический. Количественно оценить флавоноиды этим методом возможно при наличии 0.05-1 мкг вещества в 1 мл раствора. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных веществ в тканях растений. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохимических препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии [19].

1.3.3.2 Абсорбционная спектроскопия

 

В целом для флавоноидов  характерно поглощение в УФ-видимой области спектра (210-600 нм). Спектр поглощения флавоноидного соединения содержит, как правило, две полосы: одна из них в низковолновой (210-290 нм) части – полоса II, другая – в более длинноволновой (320-380 или 490-540 нм для антоцианидинов) части – полоса I.

Положение полос поглощения служит в некоторой степени характеристическим признаком отдельных групп флавоноидов. Так, флаваноны и флаванонолы отличаются от других групп флавоноидов положением полосы II в области 270-290 нм и наличием полосы I в виде плеча при 310-330 нм (рисунок 1.12). В то время как для флавонов и флавонолов специфическим признаком служит положение полосы I в области 320-355 и 340-385 нм соответственно (рисунок 10). Для халконов характерно положение полосы II в несколько более длинноволновой области (рисунок 1.13).

 

 

Рисунок 1.12 – Положение  полос поглощения в УФ-видимой области спектра для изофлавона (1) и флавонона и флавононола (2)

 

Рисунок 1.13 – Положение  полос поглощения в УФ-видимой области спектра для  
флавона (1), флавонола (2) и халкона (3)

 

Внутри каждой группы флавоноидов  выявлена более «тонкая» картина  зависимости положения максимумов полос поглощения от структуры соединения. Например, у ряда флавонов с одинаковым 5,7-дигидроксизамещением кольца А полоса I перемещается в более длинноволновую область по мере возрастания числа гидроксильных групп в кольце В (таблица 1.4).

 

Таблица 1.4 – Зависимость  положения максимумов полос поглощения ОН-группы в кольце В у ряда флавонов

Положение ОН-группы в кольце В		Полоса I
Хризин	–	313 нм
Апигенин	4'	336 нм
Лютеолин	3',4'	349 нм
Трицетин	3',4',5'	354 нм

 

Абсорбционная спектроскопия  флавоноидов хорошо изучена, и выявленные закономерности широко используются в  целях идентификации и установления строения новых соединений. Особенно информативной является процедура  добавления шифт-реагентов, каждый из которых предназначен для выявления определенных «диагностических» признаков в структуре исследуемого соединения [13].

Шифт-реагенты принято добавлять к раствору исследуемого флавоноидного соединения в метаноле (в случае антоцианов и/или антоцианидинов – в метаноле с 0.01% хлороводородной кислоты). После добавления шифт-реагента в исходном спектре происходит сдвиг полос поглощения и по характеру этих изменений делается вывод о наличии (или отсутствии) в соединении определенных структурных фрагментов.

Часто шифт-реагенты используются для обнаружения в структуре соединений:

1. гидроксильных групп с наиболее выраженными кислотными свойствами  
   (7-ОН, 4'-ОН);
2. хелатообразующего фрагмента, т. е. сочетания 4-оксогруппы с 3-ОН- и/или 5-ОН-группами.

Гидроксильные группы различаются  по кислотности и располагаются  в следующий ряд: 7-ОН > 4'-ОН > 3'-ОН > 5-ОН. Для доказательства наличия  в структуре свободной наиболее кислой 7-ОН-группы служит слабощелочной  шифт-реагент – ацетат натрия (таблица 1.5). Несколько миллиграммов плавленого ацетата натрия добавляют к аликвоте исходного метанольного раствора исследуемого вещества, снимают спектр и сравнивают со спектром исходного раствора.