Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

 

Таблица 1.5 – Шифт-проба с ацетатом натрия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный  признак
Флавоны	I	+ (5-20)	Свободная 7-ОН-группа
Флавонолы
Изофлавоны
Флаваноны	II	+ (30-60)	Свободная 7-ОН-группа
Флаванонолы

 

 

Для доказательства свободной 4'-ОН-группы (одновременно с 7-ОН-группой) используется более сильный щелочной реагент — метоксид натрия (таблица 1.6). При этом к аликвоте метанольного раствора исследуемого соединения добавляют 2-3 капли шифт-реагента; снимают спектр сразу и еще после 3-5 минут стояния.

Для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) на рисунке 1.15 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

 

Таблица 1.6 – Шифт-проба с метоксидом натрия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный  признак
Флавоны Флавонолы	I	+ (45-65) (без изменения интенсивности)	Свободная 4’-ОН-группа
		Снижение интенсивности  со сдвигом или без сдвига	Замещенная группа 4’-OR
		Снижение интенсивности  и деградация через 3-5 мин.	Свободная 3’,4’-дигидрокси- или тригидроксигруппировка
		Появление новой слабоинтенсивной полосы 320-335 нм	Свободная 7-ОН-группа
Флавононы Флавононолы	II	Сдвиг с 280 до 325 нм	Свободная 7-ОН-группа
		Отсутствие сдвига	Замещенная 7-OR-группа
Халконы Ауроны	II	Появление красного или оранжевого окрашивания и сдвиг на 50 нм с возрастанием интенсивности	Свободная 4-ОН-группа (халконы)
			Свободная 6-ОН-и/или 4’-ОН-группы (ауроны)

 

Рисунок 1.14 – Химическая структура дигидрокемпферола

 

 

Рисунок 1.15 – УФ-спектр дигидрокемферола с использованием шифт-агентов

 

Для рамнетина (рисунок 1.16) на рисунке 1.17 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

 

 

 

 

 

Рисунок 1.16 – Химическая структура рамнетина

 

 

Рисунок 1.17 – УФ-спектр рамнетина с использованием шифт-агентов

 

Для атеметина (рисунок 1.18) на рисунке 1.19 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

 

 

Рисунок 1.18 – Химическая структура артеметина

 

 

Рисунок 1.19 – УФ-спектр артеметина с использованием шифт-агента

 

Для дигидрофизетина  (рисунок 1.20) и физетина (рисунок 1.21)  на рисунке 1.22 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов [13].

 

 

Рисунок 1.20 – Химическая структура дигидрофизетина

 

 

Рисунок 1.21 – Химическая структура физетина

 

Шифт-проба с ацетатом натрия для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) приводит к батохромному сдвигу полосы II на 36 нм, что соответствует наличию 7-ОН-группы во флаванонолах (см. табл. 6). В то же время артеметин, в структуре которого присутствуют замещенные (метилированные) гидроксильные группы в положениях 7 и 4', не дает положительной шифт-пробы с ацетатом натрия (отсутствует батохромный сдвиг полосы 1) (рисунок 1.19).

Широко используемой является реакция взаимодействия флавоноидов  с хлоридом алюминия. Флавоноиды способны образовывать комплексные соединения с включением ионов А1³⁺. Считается, что в образовании комплекса с ионами металлов могут участвовать три центра в структуре молекулы флавоноида (рисунок 1.23).

 

 

Рисунок 1.22 – УФ-спект дигидрофизетина и физетина с добавлением шифт-агента

 

 

Рисунок 1.23 – Возможные  центры хелатирования флавоноидами ионов металлов

 

В результате комплексообразования в УФ-спектрах поглощения наблюдается сильный батохромный сдвиг полос поглощения I или II в зависимости от типа флавоноидного соединения (таблица 1.7). Для определения центров комплексообразования – снимают спектр (1) метанольного раствора исследуемого раствора исследуемого вещества. К аликвоте метанольного раствора исследуемого вещества добавляют 2-3 капли 5%-го метанольного раствора А1С1₃ и снимают спектр (2). Спектры (1) и (2) сравнивают между собой [13].

Например, в УФ-спектре кверцетина максимум полосы I сдвигается с 375 до 435 нм (батохромный сдвиг) и соответственно раствор приобретает яркое желтое окрашивание. На этом основано использование спиртового раствора AlCl₃ в качестве проявляющего реагента в ТСХ флавоноидов.

Для рамнетина, в молекуле которого в комплексообразовании могут участвовать три центра, шифт-проба с AlCl₃ приводит к батохромному сдвигу полосы I на 80 нм (рисунок 1.17), а в артеметине, где возможность комплексообразования ограничена одним центром, поскольку имеется только одна свободная ОН-группа в положении 5, батохромный сдвиг в результате шифт-пробы с А1С1₃ составляет 32 нм (рисунок 1.15). Отсутствие в молекуле 5-ОН-группы и возможность участия в комплексообразовании только двух других центров, как это показано на рисунке 1.22 на примере физетина, приводит тем не менее к довольно большому батохромному сдвигу – на 96 нм.

 

Таблица 1.7 – Шифт-проба с хлоридом алюминия

Группа флавоноидов	Полоса поглощения	Сдвиг, нм	Детектируемый структурный  признак
Флавоны Флавонолы	I	35-70     Нет сдвига	Свободные 5-ОН-и/или 3-ОН-группы   Отсутствуют или амещены 3-ОН-и/или 5-ОН-группы
Флаваноны Флаванонолы Изофлавоны	II	10-25	Свободная 5-ОН-группа
Халконы Ауроны	I I	40-64   60-70	Свободная 2’-ОН-группа   Свободная 4-ОН-группа

 

Для дигидрофлавонолов в целом шифт-пробы с А1С1₃  характеризуются меньшими бахромными сдвигами. Например, в случае дигидрокемферола бахромный сдвиг равен 25 нм (рисунок 1.15), а дигидрофизетина – 31 нм (рисунок 1.22).

Наибольший батохромный  сдвиг соответствует комплексообразованию с одновременным участием всех трех потенциальных центров молекулы (рисунок 23). При этом более прочными считаются комплексы, образованные с участием карбонильной группы и 5-ОН- и/или 3-ОН-группами. Комплекс с 3',4'-дигидроксигруппировкой в кольце В нестабилен, легко разрушается в слабокислой среде и соответственно при этом уменьшается батохромный сдвиг, что, в свою очередь, служит тестом для обнаружения этой дигидроксигруппировки в молекуле. Так, для рамнетина шифт-проба с А1С1₃ + НС1 приводит к уменьшению батохромного сдвига на 28 нм по сравнению с шифт-пробой с А1С1₃ (рисунок 1.17).

Проблема состава комплексов флавоноидов с ионами металлов является предметом многочисленных научных  исследований и нельзя сказать, что  она решена и в настоящее время. Доказано, что хелатирование кверцетина с А1³⁺ происходит только по двум центрам: во-первых, с участием 4-оксогруппы и 3-ОН-группы и, во-вторых, с участием 3',4'-дигидрокси - группировки (рисунок 1.24 и 1.25) [13].

 

 

Рисунок 1.24 – Центры хелатирования комплексов кверцетина с хлоридом алюминия

 

 

1 – кверцетин; 2 – кверцетин-А1С1₃ (2:1, моль); 3 – кверцетин-А1С1₃ (0,1:1, моль)

 

Рисунок 1.25 – УФ-спектр комплексов кверцетина с хлоридом алюминия:

 

 Гидроксильная группа  в положении 5 не участвует  в хелатировании в силу своей низкой кислотности. Образование хелата с участием 5-ОН- и 4-оксогруппы стерически затруднено из-за возникновения в молекуле соседнего хелата.

В настоящее время происходит смена «приоритетов» и зачастую сложные структурные вопросы  решаются уже более «коротким», но более технически оснащенным путем за счет высокоразрешающих современных физико-химических методов [13].

1.3.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов

 

Широкое распространение  в анализе получили комбинированные  методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или  определением площади пятна па хроматограмме [10].

1.3.4.1  Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов

 

Хроматомасспектрометрия – метод анализа смесей, преимущественно органических веществ, и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов – хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго – идентификацию и определение строения вещества, количественного анализа. Известны два варианта хроматомасспетрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с ВЭЖХ.

При сочетании ГЖХ и  масс-спектрометрии совместимость  этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое  вещество находится в газовой  фазе, рабочие температурные интервалы  одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки. Различие состоит в том, что  в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10^-5 – 10^-6 Па), тогда как давление в хроматографической  колонке 10⁵ Па. Для понижения давления используют молекулярный сепаратор, который одним концом соединен с выходом хроматографической колонки, а другим – с ионным источником масс-спектрометра. Молекулярный сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. При этом давление на выходе колонки понижается до рабочего давления в масс-спектрометре.

Принцип действия молекулярных сепараторов основан либо на различии подвижности молекул газа-носителя и анализируемого вещества, либо на их различной проницаемости через полупроницаемую мембрану. Чаще всего применяют энжекторные сепараторы, работающие по первому принципу. Одностадийные сепараторы этого типа содержат две форсунки с отверстиями небольшого диаметра, которые установлены точно напротив друг друга. В объеме между форсунками создается давление 1.33 Па. Газовый поток из хроматографической колонки через первую форсунку со сверхзвуковой скоростью попадает в область вакуума, где молекулы распространяются со скоростями, обратно пропорциональными их массе. В результате более легкие и быстрые молекулы газа-носителя откачиваются насосом, а более медленные молекулы органического вещества попадают в отверстие второй форсунки, а затем в ионный источник масс-спектрометра. Некоторые приборы снабжены двухстадийным молекулярным сепаратором, снабженным еще одним подобным блоком форсунок. В объеме между ними создается высокий вакуум. Чем легче молекулы газа-носителя, тем эффективнее они удаляются из газового потока и тем выше обогащение органическим веществом.

Наиболее удобный для  хроматомасспектрометрии газ-носитель – гелий. Эффективность работы сепаратора, то есть отношение количества органического вещества в газовом потоке, выходящем из колонки, к его количеству, поступающему в масс-спектрометр, в значительной степени зависит от расхода газа-носителя, попадающего в сепаратор. При оптимальном расходе 20-30 мл/мин удаляется до 93% газа-носителя, а в масс-спектрометр поступает более 60% анализируемого вещества. Такой расход газа-носителя типичен для насадочных колонок. В случае использования капиллярной хроматографической колонки расход газа-носителя не превышает  
2-3 мл/мин, поэтому на ее выходе в газовый поток добавляют дополнительное количество газа-носителя, чтобы скорость потока, поступающего в молярный сепаратор, достигла 20-30 мл/мин. Тем самым обеспечивается наилучшая эффективность молекулярного сепаратора. Гибкие кварцевые капиллярные колонки могут вводиться непосредственно в ионный источник. В этом случае ионный источник должен быть обеспечен мощной откачивающей системой, поддерживающей высокий вакуум.

В масспектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества.

Анализируемое вещество (обычно в растворе) вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а пары в смеси с газом-носителем под давлением поступают в колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент в токе газа-носителя по мере элюирования из колонки поступает в молекулярный сепаратор. В сепараторе газ-носитель в основном удаляется и обогащенный органическим веществом газовый поток поступает в ионный источник масс-спектрометра, где молекулы ионизируются. Число образующихся при этом ионов пропорционально количеству поступающего вещества. С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества [16,20].