Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 26 Апреля 2013 в 12:12, дипломная работа

Краткое описание

Целью дипломной работы является разработка методики качественного и количественного анализа природных флавоноидов (рутина и кверцетина) с использованием спектрофотометрического и хроматомасспектрометрического методов.
Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:
выявить необходимость качественного и количественного анализа биофлавоноидов;
выявить особенности (строение, физические и химические свойства) природных флавоноидов как объектов исследования;
проанализировать содержание рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье;
изучить современные методы выделения и идентификации флавоноидов;
изучить теоретические вопросы анализа методами спектрофотометрии и хроматомасспектрометрии;

Содержание

Введение 8
1 Общая часть 10
1.1 Краткая характеристика флавоноидов 10
1.2 Подготовка растительного сырья, идентификация, выделение и разделение флавоноидов 14
1.2.1 Сушка растительного сырья 14
1.2.2 Первичное исследование растительного сырья 15
1.2.3 Экстрагирование флавоноидов из растительного сырья 17
1.2.4 Хроматографические методы идентификации флавоноидов 18
1.2.4.1 Тонкослойная хроматография 18
1.2.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 20
1.3 Количественное и качественное определение флавоноидов 22
1.3.1 Химические методы исследования флавоноидов 22
1.3.1.1 Методы качественной идентификации флавоноидов 22
1.3.1.2 Объемные методы количественного определения флавоноидов 26
1.3.2 Электрохимические методы исследования флавоноидов 26
1.3.2.1 Потенциометрический метод количественного определения флавоноидов 26
1.3.2.2 Полярографические методы количественного определения флавоноидов 27
1.3.2.3 Метод капиллярного электрофореза 27
1.3.3 Физико-химические методы исследования флавоноидов 31
1.3.3.1 Оптические методы определения флавоноидов 31
1.3.3.2 Абсорбционная спектроскопия 34
1.3.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов 45
1.3.4.1 Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов 45
2 Специальная часть 50
2.1 Выбор объекта исследования 50
2.1.1 Характеристика исследуемого сырья 50
2.1.1.1 Цветки календулы 50
2.1.1.2 Трава пустырника 51
2.1.1.3 Плоды боярышника 51
2.2 Методики экспериментов и анализов 52
2.2.1 Методы отбора проб 52
2.2.2 Метод определения влажности лекарственного растительного сырья 53
2.2.3 Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом 54
2.2.4 Количественное определение рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии 57
2.2.5 Использованные реагенты 60
2.3 Результаты и обсуждение 61
2.3.1 Определение влажности 61
2.3.2 Количественное определение суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом при оптимальных условиях экстрагирования 62
2.3.3 Количественное определение флавоноидов в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии 63
3 Экономическая часть 69
Введение 69
3.1 Определение затрат на проведение исследования 74
3.1.1 Материальные затраты 74
3.1.2 Затраты на израсходованную электроэнергию 75
3.1.3 Заработная плата исполнителей исследования 76
3.1.4 Амортизационные отчисления 76
3.1.5 Расчет отчислений в социальные фонды 77
3.1.6 Определение накладных расходов 78
3.1.7 Смета затрат 78
Заключение 79
4 Безопасность и экологичность 80
4.1 Идентификация опасных и вредных факторов при работе в химической лаборатории 80
4.1.1 Основные понятия и гигиенические требования к производственному освещению 81
4.1.2 Влияние вибрации на условия труда в химической лаборатории 82
4.1.3 Влияние шума на организм человека 82
4.1.4 Вредные вещества в воздухе рабочей зоны и их воздействие на организм человека 83
4.2 Техника безопасности при работе в химической лаборатории 85
4.2.1 Общие требования безопасности при работе в лаборатории 85
4.2.2 Требования охраны труда перед началом работы 86
4.2.3 Требования охраны труда во время работы 86
4.2.4 Требования охраны труда по окончании работы 88
4.3 Общие положения по технике безопасности при использовании электроустановок в лаборатории 89
4.4 Эксплуатация электроприборов 89
4.5 Требования охраны труда в аварийных ситуациях 90
4.5.1 Общие требования безопасности в аварийных ситуациях 90
4.5.2 Требования безопасности в аварийных ситуациях при использовании электроустановок в лаборатории 91
4.5.3 Первая помощь пострадавшим от электрического тока 91
4.5.4 Требования безопасности в аварийных ситуациях при возникновении пожара в лаборатории 92
4.5.5 Действия по оказанию первой помощи пострадавшим 93
4.6 Экологичность эксперимента 94
4.7 Расчет осветительной установки для учебно-аналитической лаборатории 95
Заключение 100
Список использованных источников 101

Скачать в ZIP архиве (1.66 Мб) Сколько стоит заказать работу?

Вложенные файлы: 1 файл

Весь Диплом.docx

— 1.69 Мб (Скачать файл)

2.2.3 Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом

При оценке качества растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, наибольшее распространение получил спектрофотометрический метод анализа, основанный на использовании реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Фотометрический метод определения без предварительного разделения компонентов основан на аддитивности значений оптической плотности всех компонентов смеси при одной длине волны. Метод достаточно прост в исполнении, является высокочувствительным и относительно недорогим, что делает его предпочтительным для использования в контрольно-аналитических лабораториях. Использование такого метода позволяет определить сумму флавоноидов в присутствии других полифенольных соединений, не образующих комплекса с алюминием хлорида в среде 30-96% спирта [24].

В качестве стандарта используется тот флавоноид (рутин, кверцетин, гесперетин и т.д.), максимум поглощения комплекса которого наиболее соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия исследуемого образца.

В дипломной работе в качестве стандарта использовался ГСО рутина и ГСО кверцетина, так как максимумы поглощения комплексов с хлоридом алюминия рутина/кверцетина и экстрактов боярышника, пустырника и календулы наблюдаются при наиболее близких значениях длин волн.

Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре ПЭ-5300В в интервале длин волн 408-616 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Оборудование, материалы и реактивы:

мерная колба объемом 100 см³ – 1 шт.;
мерные колбы объёмом 25 см³ – 6 шт.;
пипетки объёмом 1 см³– 3 шт.;
пипетки объёмом 5 см³ – 1 шт.;
мерный цилиндр объемом 100 см³;
часы;
кюветы на 10 мм;
спектрофотометр ПЭ-5300В;
экстракт пустырника;
экстракт боярышника;
экстракт календулы;
алюминия хлорид 5%;
спирт этиловый 70%;
спирт этиловый 95%.

Подготовка к анализу

Приготовление 5%-го раствора алюминия хлорида

5 г алюминия хлорида х.ч. или ч.д.а. (ГОСТ 3759-75) растворяют в 50 мл 95% спирта в мерной колбе на 100 мл, доводят объём раствора этим же спиртом до метки и перемешивают.

Срок годности раствора 3 месяца.

Для анализа было приготовлено 250 мл 5% раствора алюминия хлорида в 70% спирте.

Приготовление 70%-го этилового спирта

Для приготовления 1л 70% этилового спирта смешивают 675 г этилового спирта 95% и 325 г воды. В объемных единицах 95% этилового спирта – 855 см³, воды – 325 см³. После приготовления раствора проверяют его плотность или объемную долю спирта ареометром (ГОСТ 3639-79).

Приготовление экстрактов

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0.5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% спирта этилового. Колбу взвешивают с погрешностью ±0.01 г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают в термостате при температуре 60 °С в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы 70% спиртом этиловым. Содержимое колбы фильтруют через воронку диаметром 7 см с вложенным ватным тампоном, отбрасывая первые 20 мл фильтрата [21].

Проведение спектрофотометрического анализа

В мерную колбу вместимостью 25 мл, предварительно взвешенную, переносят с помощью пипетки аликвоту анализируемого экстракта, равную 1 мл, и вновь взвешивают. В колбу с помощью пипетки добавляют 4 мл 5% раствора хлорида алюминия. Для приготовления раствора сравнения во вторую колбу вместимостью 25 мл с помощью пипетки переносят аликвоту (1 мл) анализируемого экстракта, после чего объем обеих колб доводят до метки 70% спиртом и оставляют на 30 мин. В случае помутнения растворов их фильтруют через бумажные фильтры в чистые стаканы.

Оптическую плотность измеряют в интервале 408-616 нм на длине волны максимума поглощения в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм, в рабочую кювету помещают раствор с добавленным хлоридом алюминия, в кювету сравнения – раствор сравнения. Если максимум поглощения расположен в области 408-420 нм, в качестве стандарта используют ГСО рутина. Если максимум поглощения расположен в области 421-435 нм, в качестве стандарта используют ГСО кверцетина [24].

Массовую долю суммы Р-активных флавоноидов в исследуемых экстрактах в пересчете на рутин в мг/ 100г (Х) вычисляют по формуле:

(2.2)

где, с – количество рутина в анализируемой аликвоте экстракта, соответствующее измеренной оптической плотности по калибровочному графику, г/25 см³;

F_р – фактор разбавления;

10⁵ – коэффициент пересчета в мг/100г;

М – масса экстракта, г.

2.2.4 Количественное определение рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Применимость и аналитические качества масс-спектрометрии в области количественного определения природных флавоноидов в значительной мере определяются возможностью ее комбинации с другим методом, таким как жидкостная хроматография. Соединение жидкостного хроматографа и массспектрометра осуществляется с помощью интерфейса, обеспечивающего удаление большей части жидкой фазы из пробы перед поступлением ее в массспектрометр.

В настоящее время предложено много различных типов интерфейсов, но применяются преимущественно устройства с электрораспылением и ионизацией при атмосферном давлении, которые выполняют функции удаления жидкой фазы и ионизации молекул анализируемых веществ. Анализ данных хромато-масс-спектрометрии производится двумя способами. По первому способу осуществляется анализ масс-спектров, зарегистрированных в различных точках масс-хроматограммы, путем сравнения с масс-спектрами эталонов, собранными в базе данных (библиотечный поиск), или же структурные фрагменты молекулы определяются с использованием спектро-структурных корреляций. По второму способу регистрируются и анализируются масс-хроматограммы по полному ионному току, по отдельным ионам или группам ионов. Такие ионные масс-хроматограммы позволяют обнаруживать и подтверждать структуру компонентов смеси и применимы для количественного определения флавоноидов.

Оборудование, материалы и реактивы:

Жидкостной хроматограф Dionex UltiMate3000 для решения различных аналитических задач;
Масс-спектрометр API 2000 производства Applied Biosystems для высокопроизводительных рутинных исследований;
ГСО рутина;
ГСО кверцетина;
мерные колбы объёмом 25 см³ – 2 шт.;
мерная колба объемом 50 мл – 2 шт.;
виалки с пробой – 12 шт.;
экстракт пустырника
экстракт боярышника
экстракт календулы
спирт этиловый 70%

Подготовка к анализу

Приготовление раствора ГСО рутина: около 0.05 (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 часов, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в 40 мл 70 % водного спирта при нагревании на водяной бане. После растворения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70 % спиртом до метки [25].
Приготовление раствора ГСО кверцетина проводилось по методике аналогичной методике приготовления ГСО рутина (см. выше).
Методика приготовления экстрактов из растительного сырья

Приготовление экстрактов из цветков календулы, плодов боярышника и травы пустырника проводилось аналогично методике, описанной в п. 2.2.3.

Проведение количественного анализа биофлавоноидов в растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Анализ проб экстрактов проводился с использованием жидкостного хроматографа Dionex UltiMate 3000, оснащенного трехквадрупольным масс-спектрометром API 2000 c ионизацией электростатическим распылением при атмосферном давлении (API-ES). Регистрация и обработка данных проведена с использованием программного комплекса «Analyst 1.5».

Хроматографическое разделение флавоноидов осуществлялось на хроматографической колонке Luna C18 длиной 300 мм и внутренним диаметром 2 мм, в изократическом режиме при следующих условиях:

Подвижная фаза: компонент А – вода (0.37 % раствор муравьиной кислоты);

компонент В – ацетонитрил (0.33 % раствор муравьиной кислоты).

Скорость подачи подвижной фазы: 0.250 мл/мин.

Объем вводимой пробы: 100 мкл.

Давление на входе колонки: 80 атм.

Температура термостата колонки: 50◦С.

Время анализа: 15 мин.

Состав подвижной фазы на выходе из хроматографической колонки регистрировался масс-спектрометрически. В ходе масс-спектрометрического анализа регистрировались хроматограммы по ионному току, обусловленные положительно-заряженными ионами 303 и 610 m/z, соответствующие молекулярным ионам кверцетина и рутина соответственно. Пример хроматограммы представлен на рисунке 2.1.

Рисунок 2.1 – Хроматограмма рутина и кверцетина

Ионизация потока элюэнта проводилась при следующих условиях:

температура в источнике ионов – 180◦С;

давление в распылителе: атмосферное (азот);

напряжение на капилляре: 4500 В;

газ 1 (обдув капилляра) – 40 мл/мин;

газ 2 (на входе в источник) – 50 мл/мин;

газ 3 (в источнике) – 90 мл/мин.

Проведение анализа осуществлялось в день приготовления экстрактов для предотвращения окисления флавоноидов.

2.2.5 Использованные реагенты

Сведения об использованных реактивах представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1 – Список использованных реактивов

№ п/п	Наименование, формула	Производитель, марка
1.	Трава пустырника	ОАО «Здоровье», серия 40845
2.	Плоды боярышника	ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика», серия 70807
3.	Цветки календулы	ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика», серия 50507
4.	Алюминия хлорид АlCl₃	ГОСТ 3759-75, ч.д.а.
5.	Кверцетин C₁₅H₁₀O₇	ООО «Фитопанацея», ТУ 2638-012-80884467-10, 99.57
6.	Рутин C₂₇H₃₀O₁₆	ООО «Фитопанацея», ТУ 2638-011-80884467-10, 98.59.
7.	Спирт этиловый 95%; C₂H₅OH	ООО «Реактив», х.ч.
8	Серная кислота, концентрированная H₂SO₄	Пр-во ОАО «Реактив», Санкт-Петербург, ч.д.а.

2.3 Результаты и обсуждение

В ходе работы проводилось исследование лекарственного растительного сырья на количественное содержание биофлавоноидов (рутина и кверцетина).

Производителями анализируемого сырья являются «Тверская фармацевтическая фабрика» и ОАО «Здоровье».

Для объективной оценки были выбраны три образца лекарственного растительного сырья, представленных в таблице 2.2.

Таблица 2.2 – Наименование и производители лекарственного растительного сырья

№ пробы	Наименование растительного сырья	Производитель
Проба 1	Трава пустырника сердечного	«Здоровье»
Проба 2	Цветки календулы лекарственной	«Тверская фармацевтическая фабрика»
Проба 3	Плоды боярышника кроваво-красного	«Тверская фармацевтическая фабрика»

Информация о работе Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье