Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

Реферат

 

Дипломная работа выполнена в лаборатории “Микробиологического мониторинга и биоремедиации почв” Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии. Работа посвящена селекции штаммов ассоциативных  микроорганизмов обладающих углеводородокисляющей и ростстимулирующей активностью. В экспериментальной части данного исследовательского проекта была проведена сравнительная оценка 30 штаммов микроорганизмов относящихся к родам Rhodococcus, Variovorax, Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus и Pseudomonas. По результатам поставленных опытов были выявлены 11 штаммов микроорганизмов, обладающих биодеструктивным потенциалом к углеводородам нефти. Отобранные микроорганизмы были изучены на предмет ростстимулирующей активности, и по экспериментальным данным мной были выявлены: 5 штаммов микроорганизмов, отличающихся наибольшей способностью к продукции фитогормонов ауксинов, 2 штамма – к продукции АЦК дезаминазы и 3 штамма, обладающих способностью к разложению труднодоступных фосфатов. По результатам всей экспериментальной части было выявлено 3 наиболее активных штамма для создания консорциума бактерий, обладающих несколькими или одним из ростстимулирующих свойств и углеводородокисляющей активностью, которые важны для разработки новых технологий фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

 

Ключевые слова: бактерии, Rhodococcus, Variovorax, АЦК дезаминаза, ауксины, ризосфера, нефть, фито- и биоремедиация.

 

Работа изложена на 89 страницах, содержит 7 таблиц, 11 рисунков. Библиография включает 66 источников литературы.

 

Оглавление

 

	Введение	7
1	Аналитический обзор	9
1.1	Проблема загрязнения почв нефтью	9
1.1.1	Актуальность проблемы и источники нефтяного загрязнения	9
1.1.2	Факторы определяющие характер и степень нефтяного загрязнения почв	11
1.1.3	Предельно допустимые концентрации загрязнений	15
1.2	Влияние нефти и нефтепродуктов на растения и почвенные микроорганизмы	16
1.2.1	Влияние нефтяного загрязнения на растения	16
1.2.2	Влияние нефтяного загрязнения на микробиологические процессы в почве	20
1.3	Микробная деградация углеводородов нефти	22
1.3.1	Микроорганизмы – деструкторы нефти и нефтепродуктов	22
1.3.2.1	Пути поступления углеводородов нефти в клетки микроорганизмов	26
1.3.2.2	Микробиологическое окисление углеводородов нефти и нефтепродуктов	27
1.4	Растительно-микробные системы для биоремедиации нефтезагрязненных почв	37
1.4.1	Ростстимулирующие ризосферные бактерии	37
1.4.2	Образование ассоциативного симбиоза	38
1.4.3	Механизмы положительного действия ризосферных бактерий на растения	41
1.4.4	Особенности приживаемости ризобактериальных инокулятов	46
1.5	Ремедиация нефтезагрязненных почв	48
1.5.1	Биоремедиация неффтезагрязненных почв с помощью микроорганизмов	48
1.5.2	Фиторемедиация нефтезагрязненных почв	53
2	Цели и задачи	57
3	Экспериментальная часть	59
3.1	Объекты исследования	59
3.2	Материалы и методы исследования	61
3.2.1	Определение углеводородокисляющей активности	61
3.2.2	Определение способности к продуцированию ауксинов по выявлению фитогормонов с использованием ВЭЖХ	63
3.2.3	Выявление АЦК-утилизирующих микроорганизмов и определение активности продуцируемого ими фермента АЦК дезаминазы	65
3.2.4	Определение способности к разложению труднодоступных фосфатов	69
3.3	Результаты исследования, их анализ и обсуждение	70
3.3.1	Результаты опыта по определению углеводородокисляющей активности	70
3.3.2	Результаты опыта по определению способности к продуцированию ауксинов по выявлению фитогормонов с использованием ВЭЖХ	76
3.3.3	Результаты опыта по выявлению АЦК-утилизирующих микроорганизмов и активности продуцируемого ими фермента АЦК дезаминазы	79
3.3.4	Результаты опыта по определению способности к разложению труднодоступных фосфатов	80
4	Выводы по работе	83
	Список литературы	85

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами является одной из важнейших мировых экологических проблем и имеет особенно острую необходимость решения для нефтедобывающих стран, в том числе и для России. Широкое применение в очистке нефтезагрязненных почв получили углеводородокисляющие микроорганизмы, которые служат основой для различного типа биопрепаратов и технологий биоремедиации. Нефть - чрезвычайно сложный и разнообразный по составу субстрат, и это, с одной стороны, определяет трудности очистки почв, но с другой стороны обуславливает широкий спектр микроорганизмов, которые могут использовать различные компоненты и фракции нефти для питания.

Углеводородокисляющие бактерии широко распространены и присутствуют в различных типах почв и климатических регионах. Поэтому выбранный тип технологии биоремедиации основан на активизации растительно-микробного взаимодействия наилучшим образом обеспечивающим осуществление комплексной очистки нефтезагрязненных почв.

Актуальными являются разработка способов повышения устойчивости растений к стрессовым факторам и улучшения их минерального питания. Создание сортов растений с повышенной устойчивостью к стрессам связано с большими трудностями, поскольку генетика и селекционный процесс видов растений, используемых для фиторемедиации, изучены слабо, а в природе часто несколько стрессовых факторов действуют одновременно, что также усложняет решение проблемы этим подходом.

Перспективным направлением исследований по повышению адаптации растений к стрессовым факторам является активизация их взаимодействий с полезными симбиотическими микроорганизмами, которые фиксируют атмосферный азот, стимулируют рост продуцируемыми фитогормонами, повышают доступность растениям элементов минерального питания, осуществляют биоконтроль фитопатогенов и индуцируют системную устойчивость.

Основная цель выполняемой работы заключается в отборе и детальной характеристике штаммов антистрессовых симбиотических бактерий, повышающих адаптационный потенциал растений к стрессовым факторам среды и осуществляющих деструкцию нефтезагрязнений почвы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Аналитический обзор

 

1. Проблема загрязнения почв нефтью

 

1.1.1 Актуальность проблемы и источники нефтяного загрязнения

 

Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами является одной из важнейших мировых экологических проблем и имеет особенно острую необходимость решения для нефтедобывающих стран, в том числе и для России.

Большинство земель в той или иной мере загpязнены сейчас нефтепродуктами. Особенно сильно это выражено в тех регионах, через которые проходят нефтепроводы, а также богатых предприятиями химической промышленности, использующими в качестве сырья нефть или природный газ. Ежегодно десятки тонн нефти загpязняют полезные земли, снижая ее плодородие, но до сих пор этой проблеме не оказывают должного внимания [1].

Основной источник загpязнения почвы нефтью - антропогенная деятельность. В естественных условиях нефть залегает под плодородным слоем почвы на больших глубинах и не производит существенного на нее влияния. В нормальной ситуации нефть не выходит на поверхность, происходит это только в редких случаях в результате подвижек горных пород, тектонических процессов, сопровождающихся поднятием грунта.

Основные загpязнения нефтью происходят в районах нефтепромыслов, нефтепроводов, а также при перевозке нефти по сухопутным и, особенно, морским магистралям. Так, при одном порыве нефтепровода выбрасывается в среднем 2 т нефти, что выводит из строя 1000 м³ земли, а в результате аварии на газоконденсатопроводе на землю в среднем попадает не менее 2 млн. т/год нефтепродуктов. В районах наземных нефтепромыслов и нефтепроводов периодически происходят локальные утечки нефти и нефтепродуктов, которые не распространяются на большие площади [2].

Районы и источники загрязнений нефтью можно условно разделить на две гpуппы: временные и постоянные («хронические»). К временным районам можно отнести нефтяные пятна на водной поверхности, разливы при транспортировке. К постоянным относятся районы нефтедобычи, на территории которых земля буквально пропитана нефтью в результате многократных утечек.

Экологические последствия загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами зависят от параметров загpязнения, свойств почвы и характеристик внешней среды.

Нефть представляет собой жидкость от желто или светло-бурого до черного цвета, с характерным запахом. Это смесь углеводов и их производных, каждый из которых может рассматриваться как самостоятельный токсикант. В ее составе обнаруживается свыше 1000 индивидуальных органических веществ, содержащих 83 - 87% углерода, 12 14% водорода, 0,5 - 6,0% ceры, 0,02 - 1,7% азота, 0,005 - 3,6% кислорода и незначительную примесь минеральных соединений; зольность нефти не превышает 0,1 %. Нефть легче воды: плотность различных видов нефти колеблется от 0,73 до 0,97. К нефтепродуктам обычно относят различные углеводородные фракции, получаемые из нефтей. Основные компоненты нефтепродуктов – углеводороды. Наряду с углеводородами в нефтепродуктах, как и в нефтях, также содержатся соединения серы, азота и кислорода [3].

В зависимости от месторождения нефть имеет различный состав как качественный, так и количественный. Больше всего предельных углеводородов содержится в нефти, добываемой в штате Пенсильвания (США). Бакинская нефть сравнительно бедна предельными углеводородами, но богата так называемыми нафтеновыми углеводородами, содержащимися в количестве до 90%. Значительно богаче предельными углеводородами гpозненская нефть, сураханская и ферганская (Средняя Азия) [4].

 

1.1.2 Факторы определяющие характер и степень нефтяного загрязнения почв

 

К первой гpуппе факторов относятся химическая природа загpязняющих веществ, концентрация их в почве, срок от момента загpязнения и др. Как было отмечено выше, нефть состоит из многих фракций, существенно различающихся между собой по физико-химическим свойствам. Поэтому их поведение в почве различно.

Наибольшей проникающей способностью обладают легкие фракции, которые капиллярными силами затягиваются на глубину до 1 метра. Будучи загpязнена только легкими фракциями, почва со временем может самоочиститься, так как эти фракции обладают низкими температурами кипения и довольно быстро испаряются. Легкая фракция нефти, куда входят наиболее простые по строению низкомолекулярные метановые (алканы), нафтеновые (циклопарафины) и ароматические углеводороды – наиболее подвижная часть нефти. Большую часть легкой фракции составляют метановые углеводороды с числом углеводородных атомов от 5 до 11 (пектан, гексан, гептан, октан, нонан, декан, ундекан). Нормальные (неразветвленные) алканы составляют в этой фракции 50-70%. Метановые углеводороды легкой фракции, находясь в почвах, оказывают наркотическое и токсическое действие на живые организмы. Особенно быстро действуют нормальные алканы с короткой углеводородной цепью, содержащиеся в основном в легких фракциях нефти. Эти углеводороды лучше растворимы в воде, легко проникают в клетки организмов через мембраны, дезорганизуют цитоплазменные мембраны организма. Нормальные алканы, содержащие в цепочке менее 9 атомов углерода, большинством микроорганизмов не ассимилируются, хотя могут быть окислены. Их токсичность ослабляется в присутствии нетоксичного углеводорода, который уменьшает общую растворимость алканов [5].

Многие исследователи отмечают сильное токсическое действие легкой фракции на микробные сообщества и почвенных животных. Легкая фракция, мигрируя по почвенному профилю и водоносным горизонтам, расширяет, иногда значительно, ореол первоначального загрязнения.

С содержанием легкой фракции коррелируют другие характеристики нефти: углеводородный состав, количество смол и асфальтенов. С уменьшением содержания легкой фракции ее токсичность снижается, но возрастает токсичность ароматических соединений, относительное содержание которых растет. Значительная часть легкой фракции нефти разлагается и улетучивается еще на поверхности почвы или смывается водными потоками. Путем испарения из почвы удаляется от 20 до 40% легкой фракции [6].

Содержание твердых метановых углеводородов (парафина) в нефти (от очень малых количеств до 15-20%) – важная характеристика при изучении нефтяных разливов на почвах. Твердый парафин не токсичен для живых организмов, но вследствие высоких температур застывания (+18 ºС и выше) и растворимости нефти (+40 ºС) в условиях земной поверхности он переходит в твердое состояние, лишая нефть подвижности.

Твердый парафин очень трудно разрушается, с трудом окисляется на воздухе. Он надолго может «запечатать» все поры почвенного покрова, лишив почву свободного влагообмена и «дыхания». Это, в свою очередь, приводит к полной деградации биоценоза [7].

К циклическим углеводородам в составе нефти относятся нафтеновые (циклоалканы) и ароматические (арены). Общее содержание нафтеновых углеводородов в нефти изменяется от 35 до 60%, в некоторых случаях составляя меньше или больше приведенных крайних значений. О токсичности нафтеновых углеводородов сведений почти не имеется. Циклические углеводороды с насыщенными связями окисляются очень трудно. Биодеградацию циклоалканов затрудняет их малая растворимость и отсутствие функциональных групп.

Ароматические углеводороды – наиболее токсичные компоненты нефти. В концентрации всего 1% в воде они убивают все водные растения; нефть, содержащая 38% ароматических углеводородов, значительно угнетает рост высших растений. С увеличением ароматичности нефти увеличивается ее гербицидная активность. Содержание ароматических углеводородов в нефти изменяется от 5 до 55%, чаще всего от 20 до 40%. Основную массу ароматических структур составляют моноядерные углеводороды – гомологи бензола. Полициклические ароматические углеводороды, т. е. углеводороды, состоящие из двух и более ароматических колец, содержатся в нефти в количестве от 1 до 4% [8].

Бензол и его гомологи оказывают более быстрое токсическое действие на организм, чем полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Последние действуют медленнее, но более длительное время, являясь хроническими токсикантами. Ароматические углеводороды трудно поддаются разрушению. Обычно они окисляются микроорганизмами [5].

Смолы и асфальтены относятся к высокомолекулярным неуглеводородным компонентам нефти. В составе нефти они играют исключительно важную роль, определяя во многом ее физические свойства и химическую активность. Структурный каркас смол и асфальтенов составляют высококонденсированные полициклические ароматические структуры, состоящие из десятков колец, соединенных между собой гетероатомными структурами, содержащими серу, кислород, азот.

По содержанию смол и асфальтенов нефти разделяются на малосмолистые (от 1-2 до 10% смол и асфальтенов), смолистые (10-20%), высокосмолистые (23-40%). Смолы и асфальтены содержат основную часть микроэлементов нефти, в том числе почти все металлы. Общее содержание микроэлементов в нефти – сотые, десятые доли процента. Смолистые вещества очень чувствительны к элементарному кислороду и активно присоединяют его. На воздухе смолистая нефть быстро густеет, теряет подвижность. Если нефть просачивается сверху, ее смолисто-асфальтеновые компоненты сорбируются в основном в верхнем, гумусовом горизонте, иногда прочно цементируя его. При этом уменьшается поровое пространство почвы. Смолисто-асфальтеновые компоненты гидрофобны. Обволакивая корни растений, они резко ухудшают поступление к ним влаги, в результате чего растения засыхают. Эти вещества малодоступны микроорганизмам, процесс их метаболизма идет медленно, иногда десятки лет. Токсическое же влияние оказывают некоторые тяжелые металлы в составе смол и асфальтенов. Последние малодоступны микроорганизмам и обычно остаются в почвах в виде прочного органно-минерального комплекса [9].