Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

Рисунок 4 – Пути микробной деградации нафталина и фенантрена

 

Большим  катаболическим  потенциалом  в  отношении  ароматических  углеводородов обладают  бактерии  рода Pseudomonas. Они способны полностью утилизировать или частично  трансформировать  такие  соединения, как  нафталин, фенантрен, флуорен  и  др.

Структурное  сходство  нафталина  и  фенантрена  и  данные  относительно  ферментов, участвующих  в  катаболизме  этих  соединений, позволили  предположить  возможность модификаций  генетических  систем  биодеградации  нафталина  с  приобретением  ими способности детерминировать деградацию фенантрена [36].

 

 

Деградация антрацена

При  биотрансформации  антрацена, антрахинон  является  тупиковым  соединением  и часто  накапливается  в  культуральной  жидкости  микроорганизмов. 6,7-бензокумарин является продуктом спонтанного замыкания кольца продукта экстрадиольного расщепления цис-1,2-дигидроксиантрацена, что предполагает обязательное существование и антрацен цис-1,2-дигидродиола – первого  интермедиата  в  пути  разложения  антрацена, найденного  у других  микроорганизмов. Были  предложены  два  пути  частичной  конверсии антрацена представленных на рисунке 8, включающие в себя трансформацию  антрацена  в  антрахинон  и параллельный процесс последовательного превращения антрацена через цис-1,2-дигидрокси-1,2-дигидроантрацен, 1,2-дигидроантрацен в 6,7-бензокумарин.

 

Рисунок 5 – Схема биоконверсии антрацена

 

 

Деградация  флуорена

Изучение  превращения  флуорена  микроорганизмами проводилось как смешанными, так и чистыми культурами. Большую роль в детоксикации флуорена и ряда других ароматических углеводородов играют бактерии рода Rhodococcus, широко распространенные в окружающей среде [37].

 

Рисунок 6 – Предполагаемые пути трансформации флуорена

Родококками

Обозначения: 1 – 9-гидроксифлуорен; 2 – 2-гидроксифлуорен; 3 – 9-флуоренон; 4 – гидроксифлуоренон; 5 – дигидроксифлуорен; 6 – β-инданон-β-гидроксиуксусная кислота; 7 – формилинданон; 8 – 1-инданон; 9 – 3,4-дигидрокумарин.

 

Окисление алкилзамещённых ароматических углеводородов

Использование  микроорганизмами  алкилзамещенных  ароматических  углеводородов для роста достаточно хорошо известно, хотя и не является обычным свойством микробных культур. Описано окисление толуола культурами Nocardia и Pseudomonas, м- и n- ксилолов, кумола, цимола, псевдокумола, 1- и 2-метилнафталинов  различными  видами  рода Pseudomonas.

Ассимиляция  простейшего  метилпроизводного  бензола - толуола – свойственна небольшому  числу  микроорганизмов. Описано  всего  несколько  культур Nocardia и Pseudomonas, способных  потреблять  это  соединение  как  субстрат  для  роста. У  разных организмов начальные этапы окисления толуола связаны или с первоочередным окислением метила, или гидроксилированием ядра.

Алкилнафталины, как субстрат для роста микроорганизмов, изучены более поверхностно. Тем  не  менее, показано, что  культуры Pseudomonas  окисляют 1- и 2-метилнафталины.

Микрорганизм  рода Pseudomonas E. Leibnitz с  сотрудниками  в  опытах  окислял ксиленолы до соответствующих оксикислот в процессе роста на среде с кукурузным экстрактом [38]:

 

Рисунок 7 – Окисление 2-оксиметаксилола бактериями рода Pseudomonas

 

Биогенное окисление нефтей различных по химическому составу

В процессе окисления нефти большую роль играет взаимное влияние угдеводородных и неуглеводородных компонентов, входящих в её состав. При анаэробном и аэробном микробиальном разрушении независимо от типа нефтей повышается их плотность, увеличивается содержание смолисто-асфальтеновых соединений, серы  и  уменьшается  концентрация  парафиновых  углеводородов  в  системе. При  этом отмечено  остаточное  накопление  нафтеновых  углеводородов.

Снижение  парафинового  потенциала  нефтей  при  биохимическом  окислении происходит за счёт удаления из модельных систем н-алканов как веществ, преимущественно потребляемых  микроорганизмами. Среди н-алканов  бактериями  лучше  усваиваются низкомолекулярные  соединения, что  было  доказано  на  углеводородах  ряда  от C14 до C20. Кроме  того, не  установлено  какой-либо избирательности  в  биоокислении  углеводородов  с

чётным  или  нечётным  числом  атомов C в  молекуле.

От  физиологических  особенностей  каждого  рода  микроорганизмов  зависит направленность  процесса  деструкции  индивидуальных углеводородов  и  их  смесей, обладающих различной степенью устойчивости к окислению.

 

Таблица 1 – Классификация компонентов нефтей по их способности к биодеградации

 

Изменение  группового  состава  нефтей  необходимо  учитывать  при  разработке технологии очистки почв от нефтяного загрязнения.

Практическая  помощь  нефтяной  микробиологии  в  решении  этой  проблемы заключается  в  выделении  чистых  культур углеводородокисляющих  микроорганизмов, установлении  их  родовой  принадлежности  и  степени  активности  в  окислении  нефтей  и нефтепродуктов.

Наиболее активные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, окисляющие в значительной степени устойчивые к биодеградации компоненты нефти, являются наиболее перспективными  для  создания  на  их  основе  биопрепаратов  по  очистке  почв от  нефтяного загрязнителя.

Исследование  же  способности  микроорганизмов  окислять  конкретные  классы углеводородов в составе нефтей, как было показано выше, позволяет в перспективе создавать биопрепараты целевого назначения [39].

 

1.4 Растительно-микробные системы для биоремедиации нефтезагрязненных почв

1.4.1 Ростстимулирующие ризосферные бактерии

Ростстимулирующие ризобактерии (plant growth promoting rhizobacteria — PGPR) играют важную роль в адаптации растения к внешним воздействиям. Таксономически эти бактерии чрезвычайно разнообразны (наиболее изучены представители родов Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Psеudomonas и Bacillus). Они обитают в ризосфере (зона почвы, непосредственно соприкасающаяся с корнями), которая служит их основной экологической нишей с наиболее благоприятными условиями, и на поверхности корней. В ризосферу из корней активно поступают сложные смеси легкодоступных  органических источников энергии и углерода, что обусловливает ее высокую микробиологическую активность и образование отличающихся от почвенного микробоценоза специфических ризосферных микробных сообществ. Разнообразие таких сообществ во многом определяется количественным и качественным составом корневых выделений, зависящим от вида, возраста и условий выращивания растения, а также от влияния комплекса почвенно-климатических факторов. В свою очередь, микробиологическая активность в ризосфере приводит к существенному изменению химических и физических свойств этой зоны и накоплению продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, биологически активных по отношению к растению. Для изучения взаимодействий растений с полезными формами бактерий в ризосфере продуктивна концепция, согласно которой ризобактерии образуют с растением единую растительно-микробную систему (ассоциацию) с новыми свойствами, детерминированными положительным взаимодействием партнеров.

В развивающемся устойчивом земледелии применение ризобактерий для улучшения роста и питания сельскохозяйственных культур служит одним из перспективных подходов. Однако механизмы взаимодействия компонентов растительно-микробных систем, условия реализации ростстимулирующего потенциала ризобактерий и критерии отбора наиболее эффективных ассоциативных штаммов во многом еще требуют фундаментального изучения [40].

1.4.2 Образование ассоциативного симбиоза

Корневые экссудаты

Важнейшим фактором образования ассоциативных симбиозов является выделительная функция корней растений.

Сведения о корневых выделениях пополнились в результате изучения их качественного состава. Большая серия работ продемонстрировала специфичность набора экссудатов в ризосфере у разных видов растений. Состав корневых выделений зависит также от стадии развития растения, условий роста, физико-химических свойств среды, в которой развивается корневая система. Корневые экзометаболиты проявляют неодинаковые физиологические свойства и представлены спектром органических соединений из разных классов. Это водорастворимые вещества, поступающие из корней в почву; высокомолекулярные полисахариды (муцигель), образующие тонкие слои на поверхности корней; отслаивающиеся клетки корневого чехлика, которые частично остаются в корневой зоне; отмирающие клетки эпидермиса; летучие и газообразные метаболиты прорастающих семян и корней [41].

Корневые выделения оказывают значительный эффект на рост и активность почвенных микроорганизмов. Благодаря использованию современных методов исследования появилось множество экспериментальных доказательств изменения структуры микробных сообществ ризосферы в зависимости от состава корневых экзометаболитов. Хорошо изученным примером взаимного влияния растений и микроорганизмов служит бобово-ризобиальный симбиоз. На ранней стадии его формирования состав и количество сигнальных молекул (флавоноидов) в корневых выделениях определяет специфичность и интенсивность взаимодействия растения с определенными видами клубеньковых бактерий, активность которых в ризосфере, в свою очередь, изменяет экссудацию сигнальных молекул растением. Похожий механизм выявлен и у арбускулярной микоризы. 

Не только симбиотические, но и другие ризосферные микроорганизмы воздействуют на корневую экссудацию. Ее усиление может происходить за счет дополнительного градиента концентрации органических соединений, направленного от поверхности корня и вызванного трофической активностью микроорганизмов, а также влияния микробных экзометаболитов. Обнаружение в корневых выделениях веществ, аналогичных по механизму действия бактериальным сигналам кворум-сенсинга (QS signal mimics), приводит к выводу о способности растения регулировать рост и активность популяций ассоциативных ризобактерий в ризосфере. Основываясь на полученных данных о роли микроорганизмов в физиологических процессах у растений, современная почвенная экология рассматривает ризосферу как систему с обратными связями, в которой трансформация биогенных элементов, сигнальных молекул и энергии определяется степенью интеграции метаболических процессов и физико-химическим состоянием партнеров. 

Возможность генетической модификации растений с целью изменения состава и количества корневых экзометаболитов, открывает перспективы для формирования микробно-растительных систем с улучшенной способностью к адаптации в стрессовых условиях и высокой продуктивностью, на что и ориентирована современная селекция [42].

Известна способность ростстимулирующих ризобактерий повышать интенсивность фотосинтеза, что может усиливать приток фотосинтатов в корни и экссудацию. Интерес также представляет повышение содержания в корневых выделениях органических кислот. Они играют важную роль в ассоциативной азотфиксации и конкурентной колонизации корней ризобактериями, повышают антифунгальную активность штаммов — антагонистов фитопатогенных грибов. Селекция подобных генотипов требует глубокого изучения корневых выделений у сельскохозяйственных культур и их метаболизма в ризосфере, поскольку необходимо четко определить процедуры проверки результатов отбора [43].

Важную роль в образовании растительно-бактериальных ассоциаций могут играть бактериальные гликопротеины — лектины, которые участвуют в колонизации корней бактериями, а также стимулируют активность растительных ферментов и ростовые процессы. Выявлено сильное ростстимулирующее действие летучих метаболитов ацетоина и 2,3-бутандиола, продуцируемых штаммами Bас. subtilis и Bас. amyloliquefaciens, в отношении Arabidopsis thaliana [44].

Колонизация  корней  ризобактериями

К необходимым условиям эффективного взаимодействия интродуцируемых популяций ризобактерий с растениями относится способность интродуцента активно колонизировать корни и поддерживать экологически значимую численность популяции. Колонизация корней ризобактериями — сложный мультистадийный и энергоемкий процесс, за который ответственно большое число бактериальных и растительных генов. Он может быть разделен на несколько стадий: хемотаксис к корневым экзометаболитам, адсорбцию, формирование микроколоний в местах интенсивной экссудации корневых метаболитов, миграцию вдоль корневой поверхности и конкуренцию с другими микроорганизмами. По данным сканирующей электронной микроскопии, микроколонии ризобактерий на поверхности корней покрыты слизеподобным слоем, предохраняющим клетки и колонию в целом от неблагоприятных воздействий.  

Для успешной колонизации корней важна способность бактерий утилизировать основные компоненты корневых выделений, в особенности низкомолекулярные органические кислоты. В ризосфере у диплоидных генотипов пшеницы с высоким относительным содержанием органических кислот в корневых выделениях численность ассоциативных азотфиксаторов и других ризобактерий росла интенсивнее.

Активная колонизация ризосферы и поверхности корней служит важным критерием отбора полезных форм ризобактерий, предназначенных для инокуляции растений [45].

 

1.4.3 Механизмы  положительного  действия  ризосферных бактерий на растения

Азотфиксация

  В основном изучены взаимодействия растений с азотфиксирующими ризобактериями (диазотрофами). Наиболее изученные ассоциативные азотфиксаторы — бактерии родов Azospirillum, Azotobacter и Klebsiella. Показано, что ассоциативная азотфиксация при определенных условиях вносит существенный вклад в обеспечение растений азотом. Среди недавних таких исследований представляет интерес сообщение, что при инокуляции бактерией Azospirillum amazonense растения риса содержали до 27 % N2 атмосферы. 

Продуцирование фитогормонов

К важнейшим механизмам взаимодействия в растительно-бактериальных ассоциациях относится продуцирование бактериями фитогормонов (ауксинов, цитокининов и гиббереллинов), витаминов и других биологически активных веществ. Наибольшее внимание уделялось роли бактериальных ауксинов в стимуляции роста и питания растений, поскольку способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) широко распространена среди ризобактерий. Изучены биохимические пути и гены, ответственные за синтез ИУК, а также фенотипические эффекты экзогенных ауксинов на растения. Выявлен положительный эффект бактериальных ауксинов на инициацию и удлинение корней, развитие боковых корней и корневых волосков, что может иметь значение для ускоренного роста, потребления питательных элементов и устойчивости растения к стрессам. Синтез ауксинов ризосферными микроорганизмами в значительной степени определяется составом корневых выделений, содержащих их основной метаболитический предшественник L-триптофан. Многие ризобактерии способны синтезировать цитокинины и гиббереллины [46].