Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

Необходимо также учитывать, что некоторые бактерии могут не только продуцировать, но и деградировать фитогормоны. Так, описаны штаммы Ps. putida, расщепляющие ИУК, что может быть использовано для снятия ингибирующего действия суперпродуцентов ИУК, к которым относятся фитопатогены, на растения. Однако как ризобактерии, расщепляющие фитогормоны, так и реакция растений на эту деструкцию требуют более детального изучения [47].

Способность к растворению труднодоступных фосфатов

Способность ризосферных бактерий растворять труднодоступные почвенные фосфаты давно рассматривается как важный механизм положительного действия на фосфорное питание растения. Недавно были обобщены результаты многолетних исследований по экологии, селекции и таксономии фосфатмобилизующих бактерий, а также их ассоциаций с растениями и эффективности инокуляции. Изучены бактериальные гены кислых фосфатаз и фитаз, расщепляющих органофосфаты, а также гены, участвующие в растворении минеральных фосфатов, например ответственные за биосинтез глюконовой кислоты. Многие бактерии могут повышать доступность фосфататов для растения за счет простого подкисления среды в процессе жизнедеятельности, в частности при утилизации сахаров с образованием органических кислот. Благодаря такому неспецифическому эффекту в определенных условиях очень многие ризобактерии могут функционировать как фосфатмобилизующие.

  Другие механизмы, облегчающие потребление питательных элементов у растений, обнаружены при изучении их взаимодействия с бактериями рода Azospirillum. Так, инокуляция активизировала транспорт протонов из клеток корней и приводила к подкислению ризосферы, что могло мобилизовать связанные в минералах питательные элементы, в том числе фосфор. Известны азоспириллы, обладающие пектолитической активностью, что вызывает повышенную ионную проницаемость у кортикальных клеток корней. Кроме того, при инокуляции растения потребление питательных элементов может изменяться из-за их трансформации в ризосфере, например с участием бактериальной нитратредуктазы [48].

Продуцирование сидерофоров

  Важную роль в повышении доступности питательных элементов способны играть бактериальные сидерофоры — низкомолекулярные вещества, хелатирующие железо и другие металлы с образованием устойчивых комплексов. В большей степени изучены сидерофоры, синтезируемые бактериями рода Pseudomonas. Продукция сидерофоров ризобактериями связана с удовлетворением их потребностей в железе и ингибированием конкурентной микрофлоры за счет образования недоступных для нее Fe-сидерофорных комплексов. Важно, что такие комплексы могут усваиваться растениями, хотя и в меньшей степени, чем Fe-содержащие соединения некоторых синтетических хелаторов железа и фитосидерофоров [49].  

Интерес к механизмам прямого воздействия ризобактерий на системы поглощения и транспорта элементов в растениях в настоящее время возрастает. Наиболее вероятно, что вышеперечисленные специфические эффекты бактерий служат причиной повышения содержания определенного элемента в растительных тканях. Существенное влияние бактерий на рост биомассы растения может не проявиться, если дефицит этого элемента не представляет собой ростлимитирующий фактор. Однако чаще наблюдают только повышение накопления (выноса) определенных элементов, обусловленное увеличением биомассы инокулированных растений. Такое действие бактерий может быть связано со стимуляцией роста корней, приводящей к освоению ими большего почвенного пространства и, следовательно, дополнительных питательных ресурсов [50]. 

Продуцирование АЦК дезаминазы

Универсальным антистрессовым эффектом обладают бактерии, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазу, благодаря которому в растениях снижается содержание этилена — сигнальной молекулы в каскаде неспецифических стрессовых реакций. Бактерии колонизируют корни растений и используют АЦК в качестве источника питания, что приводит к снижению ее содержания и, соответственно, интенсивности биосинтеза этилена в корнях. В результате ингибирующий эффект стрессового этилена на рост растения подавляется [51].

В настоящее время имеется ряд сообщений о защитном эффекте АЦК-утилизирующих ризобактерий в условиях токсического действия тяжелых металлов, дефицита или избытка почвенной влаги, а также осмотического стресса при засолении почвы. 

У растений аминокислота АЦК окисляется АЦК оксидазой до этилена с образованием углекислого газа, циановой кислоты и воды, то есть служит непосредственным предшественником при биосинтезе фитогормона этилена. Этилен вовлечен во многие звенья процессов роста и развития растений, включая прорастание семян, инициацию и удлинение тканей и органов, цветение, созревание плодов, старение тканей и реакции на стрессовые факторы. Активизация биосинтеза АЦК и этилена — неспецифическая реакция растений на различные стрессы, в которых последний действует как негативный регулятор ростовых процессов [52].

Известно, что аминокислота АЦК входит в состав корневых экссудатов и растение поддерживает ее баланс внутри и вне тканей (в ризосфере ее количество может достигать нескольких микромолей). Симбиотрофные бактерии используют АЦК как источник азотного и углеродного питания. Для поддержания равновесия концентраций растение увеличивает отток АЦК из корней в ризосферу, что приводит к снижению интенсивности биосинтеза этилена в корнях и его ингибирующего действия на растение.

Таким образом, 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминаза широко распространена у симбиотрофных бактерий. АЦК-утилизирующие бактерии снижают ингибирование роста растений этиленом, синтезируемым при абиотических и биотических стрессах, часто присутствуют на корнях растений и могут быть важным элементом растительно-микробных систем, особенно в условиях стрессов. Поэтому их следует считать перспективным компонентом нового типа бактериальных биопрепаратов со специфическим антистрессовым эффектом [53].

  Многие из этих описанных свойств бактерий и механизмов их положительного влияния на растения могут играть важную роль в защите последних от неблагоприятных условий среды и абиотических стрессов. Это обусловлено потенциальной направленностью действия ризобактерий против негативных эффектов и последствий воздействия стрессоров.

1.4.4 Особенности приживаемости  ризобактериальных инокулятов

Эффективность  инокуляции  растений  смешанными  культурами  ризобактерий

Совместное использование нескольких штаммов ризобактерий с неодинаковыми свойствами и механизмами взаимодействия с растением неоднократно рассматривалось как возможность улучшения эффективности инокуляции. Прием основан на расширении экологической пластичности и диапазона совместимости многокомпонентных бактериальных инокулятов с растением и использовании принципов аддитивности и синергизма при взаимодействии с растением нескольких ассоциантов.

В условиях сосуществования в одной пространственной зоне и конкуренции за корневые экссудаты между активно взаимодействующими друг с другом ризобактериями образуются трофические и регуляторные связи. Например, способность фиксировать атмосферный азот делает диазотрофов чрезвычайно привлекательными партнерами для многих микроорганизмов, усваивающих только минеральные формы азота. Показано, что бактерии рода Azospirillum образуют ассоциации с целлюлозоразлагающими (Cellulomonas), пектинолитическими (Bacillus) и другими ризосферными бактериями. Такие ассоциации основаны на свойстве азоспирилл использовать в качестве источника углерода продукты разложения полимеров бактериями-ассоциантами, снабжая последние фиксированным азотом.

Ризобактерии также играют роль «вспомогательных» агентов для активизации симбиотических отношений при инокуляции растений клубеньковыми бактериями и микоризными грибами. Стимулирующее действие может быть обусловлено как прямым, так и опосредованным влиянием ризобактерий на микросимбионты (в последнем случае — через положительный эффект на растение) [54].  

Ассоциации  интродуцируемых  ризобактерий  с  аборигенной  микрофлорой

Попадая с семенами в почву, интродуценты вступают в тесный контакт с аборигенной микрофлорой и должны занять экологическую нишу в корневой зоне прорастающих семян, которая привлекает многих полезных и вредных для растений микроорганизмов. Как уже отмечалось, интродуцируемые ризобактерии легко вступают в ассоциации с разнообразными микроорганизмами. С одной стороны, аборигенные микроорганизмы могут повышать доступность дополнительных питательных ресурсов для интродуцента, его выживаемость и активность в зоне корней. С другой стороны, в ризосфере в большой степени развиты взаимодействия микробов по типу антагонизма и конкуренции за корневые выделения.

Интродуцируемые ризобактерии образуют ассоциации не только с полезными, но и с вредными для растений ризосферными аборигенами. 

Таким образом, один из важных факторов выживания и активности интродуцируемых бактерий в ризосфере — взаимодействие с аборигенными микроорганизмами, в частности устойчивость к их влиянию. Слабая конкурентоспособность интродуцентов, а также образование ими ассоциации с вредной для растений микрофлорой или ингибирование активности полезных форм микроорганизмов может влиять на эффективность инокуляции и искажать ожидаемую реакцию растений на внесение ризобактерий в почву [55].  

1.5 Ремедиация нефтезагрязненных почв

Нефтяное загрязнение отличается от многих других антропогенных воздействий тем, что оно дает не постепенную, а, как правило, «залповую» нагрузку на среду, вызывая быструю ответную реакцию. При оценке последствий такого загрязнения не всегда можно сказать, вернется ли экосистема к устойчивому состоянию или будет необратимо деградировать. Во всех мероприятиях, связанных с ликвидацией последствий загрязнения, с восстановлением нарушенных земель, необходимо исходить из главного принципа: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Суть восстановления загрязненных экосистем – максимальная мобилизация внутренних ресурсов экосистемы на восстановление своих первоначальных функций. Самовосстановление и рекультивация представляют собой неразрывный биогеохимический процесс.

Естественное самоочищение природных объектов от нефтяного загрязнения - длительный процесс. В связи с этим, разработка способов очистки почвы от загрязнения углеводородами нефти – одна из важнейших задач при решении проблемы снижения антропогенного воздействия на окружающую среду [56].

1.5.1 Биоремедиация нефтезагрязненных почв с помощью микроорганизмов

Существующие механические, термические и физико-химические методы очистки почв от нефтяных загрязнений дорогостоящи и эффективны только при определенном уровне загрязнения (как правило, не менее 1% нефти в почве), часто связаны с дополнительным внесением загрязнения и не обеспечивают полноты очистки. В настоящее время одной из наиболее перспективной технологии очистки нефтезагрязненных почв считается интродуцирование в почву различных комплексов микроорганизмов, отличающихся повышенной способностью к биодеструкции тех или иных углеводородных компонентов нефти и нефтепродуктов. Нефть – чрезвычайно сложный и разнообразный по составу субстрат, и это, с одной стороны, определяет трудности очистки почв, но с другой стороны обуславливает широкий спектр микроорганизмов, которые могут использовать различные компоненты и фракции нефти для питания. Способность утилизировать трудноразлагаемые вещества антропогенного происхождения (ксенобиотики) обнаружена у многих организмов.

Это свойство обеспечивается наличием у микроорганизмов специфических ферментных систем, осуществляющих катаболизм таких соединений. Поскольку микроорганизмы имеют сравнительно высокий потенциал разрушения ксенобиотиков, проявляют способность к быстрой метаболической перестройке и обмену генетическим материалом, им придается большое значение при разработке путей биоремедиации загрязненных объектов [57].

Под термином «биоремедиация» принято понимать применение технологий и устройств, предназначенных для биологической очистки почв, т.е. для удаления из почвы уже находящихся в ней загрязнителей. Биоремедиация включает в себя два основных подхода:

1 биостимуляция  – активизация деградирующей  способности аборигенной микрофлоры  внесением биогенных элементов, кислорода, различных субстратов;

2 биодополнение  – интродукция природных и  генноинженерных штаммов-деструкторов  чужеродных соединений.

Биостимуляция in situ (биостимуляция в месте загрязнения).

Механизм самовосстановления экосистемы после нефтяного загрязнения достаточно сложен. С помощью агротехнических приемов можно ускорить процесс самоочищения нефтезагрязненных почв путем создания оптимальных условий для проявления потенциальной активности микроорганизмов, входящих в состав естественного микробиоценоза. Микроорганизмы, потребляющие  углеводороды  нефти,  являются  обычными компонентами  биоценозов  почв.  Во  всех  почвах  в  большом  количестве содержатся  микроорганизмы,  способные  окислять  углеводороды  различного происхождения (растительного,  животного,  нефтяного).  Поступление  в  почву свежего  энергетического  материала  вызывает  интенсивное  развитие углеводородоокисляющей  микрофлоры,  что  обеспечивает  утилизацию поллютанта.

Подход in situ основан на стимулировании роста природных микроорганизмов, обитающих в загрязненной почве и потенциально способных утилизировать загрязнитель, но не способных делать это эффективно из-за недостатка основных биогенных элементов (соединений азота, фосфора, калия и др.) или неблагоприятных физико-химических условий. Обеспеченность почв биогенными элементами - азотом, фосфором и калием - важный фактор, определяющий интенсивность разложения нефти и нефтепродуктов. Недостаток биогенных элементов необходимо восполнять путем внесения в почву минеральных удобрений. Практически во всех случаях внесение биогенных элементов в виде минеральных удобрений стимулирует разложение углеводородов в почве. Наиболее интенсивно разложение углеводородов протекает при ежегодном внесении комплекса N, P, K – содержащих удобрений в сочетании с навозом, а также при внесении в почву биогумуса.