Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

В этом случае в ходе лабораторных испытаний с использованием образцов загрязненной почвы устанавливают, какие именно компоненты и в каких количествах следует внести в загрязненный объект, чтобы стимулировать рост микроорганизмов, способных утилизировать загрязнитель.

Биостимуляция in vitro.

Отличие этого подхода в том, что биостимуляция образцов естественной микрофлоры загрязненной почвы проводится сначала в лабораторных или промышленных условиях (в биореакторах или ферментерах). При этом обеспечивается преимущественный и избирательный рост тех микроорганизмов, которые способны наиболее эффективно утилизировать данный загрязнитель. «Активизированную» микрофлору вносят в загрязненный объект одновременно с необходимыми добавками, повышающими эффективность утилизации загрязнителя.

Существующие два пути интенсификации биодеградации ксенобиотиков в окружающей среде – стимуляция естественной микрофлоры и интродукция активных штаммов, не только не противоречат, но и дополняют друг – друга [58].

Биорекультивация нефтезагрязненных почв – это многостадийный биотехнологический процесс, включающий физико-химические методы детоксикации загрязнителя, применение органических и минеральных добавок, использование биопрепаратов.

Основными факторами, влияющими на ход биоразрушения органических загрязнителей, являются их химическая природа (которая обусловливает возможные пути биотрансформации), концентрация и взаимодействие с другими загрязнителями (на уровне их непосредственного взаимодействия или взаимного влияния на трансформацию) [59].

К основным неблагоприятным физико-химическим условиям, лимитирующим деградацию микроорганизмами ксенобиотиков в окружающей среде, можно отнести недостаточное содержание кислорода и неблагоприятную температуру. Нефтяное загрязнение в значительной мере ухудшает газовый обмен почвы, создает условия для усиления восстановительных процессов. Для окисления углеводородов микроорганизмами необходимо наличие молекулярного кислорода, в анаэробных условиях процесс окисления крайне затруднен. Приемы обработки почв, способствующие улучшению аэрации, стимулируют активность микроорганизмов, усиливают окислительные процессы. Интенсификация разложения нефти и нефтепродуктов в почве возможна путем рыхления, частой вспашки или дискования.

Температура также является важным фактором, при прочих равных условиях определяющих интенсивность микробиологического разложения нефти и нефтепродуктов. Оптимальной температурой для разложения нефти и нефтепродуктов в почве считается 20-37°С. В связи с этим особое внимание исследователей в последнее время привлекают природные микроорганизмы, обладающие высокой устойчивостью к низким температурам.

Так же, к неблагоприятным физико-химическим условиям можно отнести низкую или чрезмерную влажность почвы, неблагоприятную кислотность, низкую концентрацию или доступность ксенобиотиков, наличие альтернативных, более предпочтительных субстратов и т.д. Среди биологических факторов отмечены поедание интродуцируемых микроорганизмов простейшими, обмен генетической информацией в популяции, физиологическое состояние и плотность интродуцируемой микробной популяции. Некоторые из перечисленных проблем могут быть решены путем создания генетически сконструированных штаммов-деструкторов и их консорциумов, усовершенствования методов интродукции, оптимизации условий существования природных микробных популяций.

Таким образом, интродукция микроорганизмов приводит к положительным результатам только при создании соответствующих условий для развития внесенной популяции, для чего необходимо знать физиологические особенности интродуцента, а также учитывать складывающиеся микробные взаимодействия [60].

1.5.2 Фиторемедиация нефтезагрязненных  почв

Фиторемедиация представляет собой использование растений для очистки окружающей среды. В этой технологии используются природные процессы, с помощью которых растения деградируют и накапливают различные поллютанты. Фиторемедиация является высокоэффективной технологией очистки от ряда органических и неорганических поллютантов.

Органические поллютанты в окружающей среде представлены, главным образом, веществами антропогенного происхождения, и для большинства организмов являются чужеродными (ксенобиотиками); многие из них токсичны, некоторые канцерогенны. В зависимости от их свойств, органические поллютанты могут или разрушаться в корневой зоне растений, или поглощаться с последующим разрушением, изолированием или испарением.

Наряду с преимуществами фиторемедиация имеет ряд ограничений. Растения, производящие очистку, должны находится в зоне загрязнения и быть способными воздействовать на поллютант. Следовательно, свойства почвы, уровень токсичности и климат должны позволять рост и развитие растений. Если почва токсична, её можно сделать более пригодной для роста с помощью внесения определённых почвенных добавок.

  Нужно также учитывать, что очистка  ограничена уровнем глубины корней, т.к. растения должны иметь контакт  с поллютантом. Корни травянистых  растений обычно достигают глубины 50 см, деревьев – 3 м, хотя некоторые  растения (особенно в аридных  районах) способны достигать глубины 15 и более метров.

В зависимости от вовлечённых биологических процессов, фиторемедиация может занять больший период времени, чем другие методы очистки. Деградация поллютантов растениями работает довольно быстро (дни/месяцы), тогда как очистка путём аккумуляции растениями занимает годы.

Также фиторемедиация может ограничиваться доступностью поллютантов растению. Биодоступность поллютантов зависит от химических свойств поллютанта, свойств почвы, условий среды, различных биологических процессов. Биодоступность поллютантов может быть увеличена путём внесения в почву определённых добавок (например, органические кислоты, понижая рН и хелатируя катионы, делают более доступными для растения загрязняющие металлы, а сурфактанты – гидрофобные органические поллютанты) [61].

Для достижения максимальной эффективности очистки фиторемедиация может использоваться в сочетании с другими методами биоремедиации и небиологическими технологиями очистки. Например, наиболее загрязнённые части субстрата могут удаляться путём экскавации, после чего дальнейшая очистка может проводиться с помощью растений.

За последние десять лет фиторемедиация приобрела большую популярность, что отчасти связано с её низкой стоимостью. Так как в процессе фиторемедиации используется только энергия солнца, данная технология на порядок дешевле методов основанных на применении техники (таких как экскавация, промывка и сжигание почвы). То, что данная технология применяется прямо в районе загрязнения (in situ) способствует снижению затрат и уменьшению контакта загрязнённого субстрата с людьми и окружающей средой [62].

Ризофильтрация

Растения могут применяться как фильтры в созданных искусственно заболоченных участках или в промышленных установках. К данной технологии в частности относится ризофильтрация - использование растений в гидропонных установках для фильтрации загрязнённой воды. Для фиторемедиации в искусственно созданных заболоченных территориях применяются различные водные виды: ряска Lemna sp. и Azolla sp. – для неорганических поллютантов (хорошие накопители металлов и лёгкий сбор биомассы), виды родов Myriophyllum и Elodea - для органических поллютантов (высокий уровень деградирующих ферментов). В процессе ризофильтрации осуществляется интенсивное аэрирование, что позволяет использовать также наземные растения, часто используются горчица Brassica juncea и подсолнечник Helianthus annuus.

Фитоэкстракция

Данная технология заключается в использовании растений для экстрагирования поллютантов и аккумулирования их в тканях, после чего надземная растительная биомасса собирается. Растительный материал может далее либо использоваться для непищевых целей (производство дерева, картона) либо сжигаться с последующим вывозом золы на свалку или, в случае ценных металлов, рециркуляцией накопленных элементов. Для фитоэкстракции часто применяют горчицу Brassica juncea и подсолнечник Helianthus annuus из-за их быстрого роста, большой биомассы и высокой устойчивости к поллютантам [63].

Фитодеградация

Некоторые растения могут напрямую деградировать органические поллютанты с помощью своих ферментов, обычно внутри тканей, до неорганических соединений или до стабильных интермедиатов, накапливающихся в растении. Технология использования растений для деградации поллютантов получила название фитодеградация. Она эффективна против органических поллютантов обладающих хорошей подвижностью в растении (гербициды, ТНТ, трихлорэтилен). Применяемые для фитодеградации виды характеризуются наличием обширной плотной корневой системой и высоким уровнем синтеза ферментов деградации (наиболее часто применяют растения тополя).

Фитоиспарение

Технология, получившая название фитоиспарение, основывается на том, что после поглощения некоторые поллютанты могут покидать растение в летучей малотоксичной форме. Если летучее соединение всё же токсично, то после испарения растением оно разбавляется в атмосфере до уровня не представляющего угрозы. Фитоиспарение может быть использовано для летучих органических соединений (трихлорэтилен) и некоторых неорганических веществ, способных переводиться растением в летучее состояние (селен, ртуть). Обычно в данной технологии применяют всё тот же тополь благодаря высокому уровню транспирации [64].

Фитостимуляция

Технология фитостимуляции состоит в применении растений для стимуляции биодеградации поллютантов микрооргаизмами в ризосфере. Такая стимуляция биодеградации осуществляется за счёт секреции растениями органических веществ, используемых ризосферными микроорганизмами в качестве источника энергии и углерода, а также различных вторичных метаболитов, активирующих гены, ответственные за синтез деградирующих ферментов. Для фитостимуляции микроорганизмов-деструкторов корневой зоны применяются растения обладающие обширной плотной корневой системой и секретирующие специфические вещества, способствующие росту этих микроорганизмов. Фитостимуляция применяется для очистки от гидрофобных органических поллютантов, в основном от углеводородов нефти, которые не могут быть поглощены растениями, но могут быть деградированы микроорганизмами [65].

Среди  перечисленного  наибольшую актуальность приобретают методы, основанные  на  использовании  объединенного  метаболического потенциала микроорганизмов и растений. Микроорганизмы-деструкторы проявляют большой углеводородокисляющий потенциал, но в процессе биоремедиации нефтезагрязненных почв возникает проблема их приживаемости. В связи с этим используется симбиотическое взаимодействие растений и микроорганизмов-деструкторов, так как ризосфера является природной экосистемой, обеспечивающей высокую численность микробных популяций и ее естественное поддержание.

Основными механизмами для фиторемедиации нефтезагрязненных почв являются стимуляция растениями почвенных микроорганизмов через ризосферный эффект и активизация деятельности микробного сообщества, и, как следствие, интенсификация биохимических и химических процессов трансформации чужеродных соединений в почве.

Таким образом, важной и основной ролью растений в детоксикации поллютантов играет ризосфера растений, которая является областью активного развития микроорганизмов-деструкторов углеводородного загрязнения почв [66].

2 Цели и задачи работы

Подход проекта основан на селекции штаммов или консорциумов бактерий, обладающих комплексом антистрессовых свойств и способности к биодеструкции нефти. Основная цель данной работы сводится к отбору и детальной характеристике штаммов микроорганизмов, повышающих адаптационный потенциал растений к стрессовым факторам среды и осуществляющих деструкцию нефтезагрязнений почвы.

Это позволит интенсифицировать процесс фиторемедиации одновременно в двух направлениях: 1 – стимуляция роста растений за счет оптимизации гормонального статуса и улучшения минерального и водного питания; 2 – активизация процессов очистки почвы за счет биодеструкции нефтезагрязнений. Важно подчеркнуть, что биодеструкция нефтезагрязнений на этапе фиторемедиации в основном осуществляется ассоциированными с растениями микроорганизмами, которые используют ресурсы растительного происхождения для углеводородокисляющих деструктивных процессов. Повышение численности их популяций обеспечит в дальнейшем интенсивную колонизацию корней растений, образование эффективных растительно-микробных систем и нитенсификацию фиторемедиации.

В ходе исследовательской работы поставлены следующие задачи:

1. Отобрать штаммы микроорганизмов отличающихся нефтедеструктивной способностью и охарактеризовать их углеводородокисляющий потенциал для разработки перспективных биотехнологических методов эффективной фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

 2. Выявить способность исследуемых штаммов микроорганизмов продуцировать фитогормоны типа ауксинов и определить количественное содержание продуцируемых фитогормонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3.   Выявить АЦК-утилизирующие микроорганизмы и определить у них способность к продукции фермента АЦК дезаминазы.

4. Определить  способность исследуемых штаммов  микроорганизмов к разложению  труднодоступных фосфатов и выявить  активных мобилизаторов фосфатов.

Так же должна быть проверена возможность создания консорциума штаммов бактерий, обладающих по возможности несколькими или одним из свойств (наличие антистрессового фермента АЦК дезаминазы, способности продуцировать фитогормоны ауксины, способности растворять труднодоступные фосфаты и утилизировать углеводороды нефти), которые важны для разработки новых технологий фиторемедиации нефтезагрязненных почв.