Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

 

 

 

 

 

3. Экспериментальная часть

 

3.1 Объекты исследования

 

Микроорганизмы, использованные в работе, включают в себя 30 штаммов бактерий, взятых из коллекции ассоциативных микроорганизмов. В рамках экспериментальных исследований данного проекта не планируется выделение штаммов бактерий из природных источников или генетическая модификация микроорганизмов. Поэтому работа будет основана на результатах изучения свойств коллекционных штаммов для получения антистрессовых и углеводородокисляющих бактерий. Все исследуемые штаммы микроорганизмов депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного значения (ВКСМ) Россельхозакадемии.

Основными объектами данной исследовательской работы являются микроорганизмы родов: Rhodococcus, Variovorax, Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus и Pseudomonas. Важно подчеркнуть, что большинство ассоциативных бактерий, в том числе содержащих АЦК дезаминазу, и продуцентов ауксинов относятся к выше перечисленным родам [47].

К тем же таксономическим группам относятся и многие углеводородокисляющие бактерии - биодеструкторы нефти [25]. Это обуславливает высокую вероятность селекции штаммов, которые сочетают в себе полезные для роста растений свойства и способные утилизировать органические загрязнения в виде нефти и нефтепродуктов.

Эти бактерии являются уникальным по биоразнообразию и функциональности биоресурсом и будут служить основным объектом исследований, что позволит успешно выполнить поставленные задачи.

 

Таблица 2 – Штаммы микроорганизмов исследуемых в экспериментальной части работы

№	Вид	Штамм	Источник выделения	Краткая характеристика
1	Rhodococcus  erythropolis	192	почва Лен. области	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
2	Rhodococcus  erythropolis	196	почва Лен. области	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
3	Rhodococcus fascians	394	семена ячменя, Дагестан	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
4	Rhodococcus  erythropolis	395	корни яблони	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
5	Rhodococcus pyyridinivorans	398	колос пшеницы	эпифит
6	Rhodococcus fascians	399	проростки овса	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
7	Rhodococcus  erythropolis	401	листья проростков овса	эпифит
8	Rhodococcus  erythropolis	402	листья проростков пшеницы	эпифит
9	Rhodococcus  erythropolis	403	листья проростков овса	эпифит
10	Rhodococcus sp.	393	корни яблони	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
11	Rhodococcus maris	346	листья черной смородины	эпифит
12	Rhodococcus fascians	392	корни проростков пшеницы	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
13	Rhodococcus  sp.	191	почва Лен. области	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
14	Bacillus subtilis	440	почва из-под плодовых деревьев, Украина	антагонист фитопатогенов
15	Pseudomonas aeruginosa	478	почва Лен. области	продуцент пигментов
16	Micrococcus luteus	220	корни пшеницы	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
17	Arthrobacter histidinolovorans	352	корни табака	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
18	Micrococcus luteus	396	почва Лен. области	продуцент β-каротина
19	Arthrobacter citreum	426	почва Лен. области	продуцент аминокислот
20	Bacillus endophyticus	107	почва Лен. области	антагонист фитопатогенов
21	Bacillus megaterium	64	почва Моск. области	фосфатредуктор
22	Bacillus koreensis	154	почва Лен. области	фосфатредуктор
23	Bacillus pumilus	128	почва Горьк. области	антагонист фитопатогенных грибов
24	Variovorax paradoxus	5c2	ризосфера горчицы сарептской	стимулятор роста
25	Rhodococcus sp.	4n44	ризосфера горчицы сарептской	стимулятор роста
26	Variovorax paradoxus	5p3	ризосфера горчицы сарептской	стимулятор роста
27	Arthrobacter     sp.	D12str	ризосфера ячменя	стимулятор роста
28	Arthrobacter histidinolovorans	409	корни овса	колонизатор ризосферы
29	Bacillus subtilis niger	120	почва, Башкортостан	антагонист фитопатогенов
30	Pseudomonas aeruginosa	188	почва Лен. области	продуцент пигментов

 

В ходе работы будут изучены следующие функциональные характеристики вышеперечисленных микроорганизмов: устойчивость бактерий к углеводородам нефти и их биодеструктивный потенциал, их ростстимулирующая активность, а именно, способность к продукции фитогормонов-ауксинов, АЦК-утилизирующая способность и продукция АЦК дезаминазы, а так же способность к растворению труднодоступных фосфатов.

3.2 Материалы и методы исследования

3.2.1 Определение углеводородокисляющей  активности

Изучение деструктивной активности штаммов по отношению к углеводородам нефти проводили, культивируя микроорганизмы в жидких средах, содержащих углеводородный субстрат (сырую нефть) в качестве единственного источника углерода и энергии.

Минеральный состав питательной среды:

K2HPO4 – 1 г/л;

MgSO4·7H2O – 0,2 г/л;

NaCl – 5 г/л;

NH4H2PO4 – 1 г/л.

Так же в минеральную среду был добавлен дрожжевой экстракт из расчета 20мг/л (200мкл/л из stock solution – 100 мг/мл) для затравки микроорганизмов.

После автоклавирования питательная среда разливалась в стерильные пробирки по 5мл в каждую.

Для посева использовалась 3-х суточная культура выбранных 30ти штаммов микроорганизмов. Концентрация вносимых в питательную среду ресуспензированных в физиологическом растворе микроорганизмов - 105 клеток на 5 мл среды.

При определении углеводородокисляющей активности использовался гравиметрический метод. Для выявления активности в пробирки с питательной средой была внесена стерильная сырая нефть по 25 мкл в каждую из расчета 5 г/л. Контролем служили пробирки с питательной средой и нефтью без внесения микроорганизмов.

При определении прироста биомассы углеводородокисляющих бактерий проводился сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре. Контролем для определения прироста служили пробирки с питательной средой и микроорганизмами без внесения нефти.

  Культивирование проходило при  температуре 280С, на круговой качалке при 110 об/мин, в течение 7 суток. Эксперимент поставлен в двукратной повторности.

Для определения деструктивной активности гравиметрическим методом по окончании культивирования была проведена экстракция нефти. При экстрагировании был использован органический растворитель хлороформ (СHСl3) в объеме 1 мл на каждую из пробирок. Хлороформ, будучи тяжелее культуральной жидкости, и экстрагированная в нем нефть переходили в нижний слой раствора. Экстракция проводилась в трехкратной повторности, каждая в течение 5 минут. Экстракты удалялись со дна пробирки пипеткой, объединялись и затем помещались в предварительно взвешенные алюминиевые кюветы. После полного удаления растворителя кюветы повторно взвешивались для определения количества частично разложившейся нефти. Наибольшая разница между массой нефти из контрольной пробирки и массой нефти из пробирок с исследуемыми культурами соответствует наибольшему количеству разложившихся углеводородов нефти до СО2 и Н2О, что говорит о наибольшей углеводородокисляющей активности штамма.

Для определения прироста биомассы был проведен сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре Smart-Spec-Plus (Biorad, США).  Наибольшая разница между оптическими плотностями культуральной жидкости исследуемых образцов и контроля соответствовала наибольшему приросту биомассы углеводородокисляющих бактерий. Измерения проводились при длине волны λ=540 нм. Опыт проводился в двукратной повторности.

По окончании опыта по экспериментальным данным было отобрано 11 наиболее активных штаммов микроорганизмов, которые подвергались дальнейшим исследованиям для изучения их ростстимулирующих свойств.

 

3.2.2 Определение способности  к продуцированию ауксинов по  выявлению фитогормонов с использованием  ВЭЖХ

Способность бактерий продуцировать ауксины изучена с помощью периодических культур.

Состав питательной среды для культивирования отобранных штаммов микроорганизмов:

KH2PO4 – 0,4 г/л;

K2HPO4 – 0,1 г/л;

MgSO4·7H2O – 0,2 г/л;

NaCl – 0,1 г/л;

Дрожжевой экстракт – 50 мг/л;

Глюкоза – 5 г/л.

В качества предшественника в биосинтезе ауксинов в питательную среду было внесено 250 мг/л L-триптофана.

Для посева использовалась 3-х суточная культура, посевная доза которой составляла 106 клеток на 5 мл среды. Бактерии культивировались в пробирках до стационарной фазы роста при 280С, в течение 5 суток в темноте.

По окончании культивирования суспензии были центрифугированы и фильтрованы через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

Для выявления штаммов с наиболее интенсивной способностью к продуцированию основного фитогормона типа ауксинов, определяющего фитостимуляцию – индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) – был проведен сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре.

Для анализа использовался реактив Сальковского, дающий характерное розово-красное окрашивание с ИУК. Наиболее интенсивное окрашивание соответствует наиболее интенсивному продуцированию ИУК.

Состав для приготовления реактива Сальковского:

FeCl3 – 1 г;

H2O – 250 мл;

H2SO4 (конц.) – 150 мл.

Реакция проводилась в соотношении супернатант : реактив Сальковского – 1 : 2, объем реакционной смеси – 1,5 мл.

Контролем для сравнительного анализа служила питательная среда без внесения микроорганизмов с добавлением того же количества реактива Сальковского. Показания снимались при длине волны λ=540 нм. Эксперимент проводился в двукратной повторности.

По окончании эксперимента было отобрано 5 штаммов микроорганизмов отличающихся наиболее активным продуцированием ИУК.

 

Отобранные в ходе эксперимента 5 штаммов микроорганизмов подвергались дальнейшему исследованию на предмет определения точного количества продуцируемого фитогормона ИУК и некоторых его производных.

Анализ проводился с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием системы Ультра Производительной жидкостной хроматографии (UPLC) на колонке с обращенной фазой Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (Waters, США) с флуоресцентным детектором. Данная система предназначена для выполнения исследований как с применением новейших методик и материалов UPLC, так и традиционными методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Суспензии отобранных культур были также центрифугированы и фильтрованы через мембранные фильтры. Для выделения ауксинов культуральные жидкости и исходные стерильные среды были экстрагированы этилацетатом, подкисленным 0,4 N HCl до рН=3,0. Полученный экстракт был выпарен при 35°C на вакуумном роторном испарителе и растворен в 150 мкл 18% ацетонитрила с последующей фильтрацией через нейлоновый мембранный фильтр Spin-X с диаметром пор 0,22 мкм (Corning, США). Идентификацию ауксинов проводили с использованием флуоресцентного детектора. Длина возбуждающей волны детектора – 280 нм, эмиссионной волны – 350 нм. Объем пробы – 150 мкл.

Ауксины разделялись на колонке 150 мм 5 мм с обращенной фазой С18 в течение 5 минут в буфере ацетонитрил - вода - уксусная кислота. Скорость подачи буфера – 0,3 мл/мин.

Количество фитогормонов в исследуемых образцах рассчитывали с помощью стандартного раствора, в котором концентрация ауксинов была заранее известна. В 5 мкл стандарта содержится: 0,0025 мкг индолил-3-молочной кислоты (ИМК); 0,05 мкг индолил-3-карбоновой кислоты (ИКК); 0,02 мкг индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

По окончании эксперимента у исследуемых образцов было определено количество продуцируемых фитогормонов.

 

3.2.3 Выявление АЦК-утилизирующих  микроорганизмов и определение  активности продуцируемого ими  фермента АЦК дезаминазы

 Выявление АЦК (1-аминоциклопропан-1-карбоксилат)  - утилизирующих бактерий проводили, культивируя микроорганизмы на специальной питательной среде для селекции бактерий, утилизирующих АЦК в качестве источника азота, с добавлением смеси органических кислот и АЦК.

Состав питательной среды:

KH2PO4 – 0,4 г/л;

K2HPO4 – 0,1 г/л;

MgSO4·7H2O – 0,2 г/л;

NaCl – 0,1 г/л;

Агар – 15 г/л;

Глюкоза – 5 г/л;

Маннит – 2,5 г/л;

Смесь органических кислот – 0,2 г/л.

Состав смеси органических кислот:

Na-citrate (Na3C6H5O7 – натриевая соль лимонной кислоты);

Na-pyruvate (CH3COCOONa – натриевая соль пировиноградной кислоты);

Na-D-gluconic acid (NaC6H11O7 – натриевая соль альдоновой (глюконовой) кислоты);

Na-acetate (CH3COONa – натриевая соль этановой (уксусной) кислоты);

Na-succinate (Na2C4H4O4 – натриевая соль бутандиовой (янтарной) кислоты);

Na-malic acid (Na2C3H2O4 – натриевая соль пропандиовой (малоновой) кислоты).

На данной выше основе было приготовлено 3 варианта питательных сред:

1. В качестве источника азота был добавлен NH4NO3 из расчета 0,4 г/л. Данная среда служила положительным контролем, с помощью которого определялась оптимальность состава среды и оценивалась эффективность выбранных источников углеродного и азотного питания для исследуемых микроорганизмов.
2. В качестве источника азота был добавлен АЦК в той же концентрации, что и NH4NO3. По росту биомассы на данной среде были выявлены АЦК-утилизирующие микроорганизмы.
3. Среда без добавления источника азота и АЦК. Данная среда служила отрицательным контролем. При сравнении роста микроорганизмов на данной среде с ростом микроорганизмов на среде с добавлением АЦК были выявлены АЦК-утилизирующие штаммы.

Засев культур на твердую питательную среду осуществлялся репликаторным методом. В 11 ячеек репликатора было добавлено по 150 мкл физиологического раствора с ресуспензированными в нем клетками исследуемых образцов. Для приготовления посевного материала использовалась 3-х суточная культура.

Культивирование микроорганизмов на всех средах проводилось в термостатах при температуре 280С.

Для выявления наиболее активных АЦК-утилизирующих бактерий на 5-е сутки культивирования была проведена сравнительная визуальная оценка интенсивности и особенности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на разных питательных средах.

 

Наиболее активные АЦК-утилизирующие бактерии подвергались дальнейшему исследованию на предмет изучения активности продуцируемого этими бактериями фермента АЦК дезаминазы.

Активность фермента определяли биохимическим методом Салеха и Глика.

Культуры отобранных активных АЦК-утилизирующих штаммов микроорганизмов были выращены в течение 24 часов при температуре 300С.

Состав питательной среды для культивирования отобранных штаммов микроорганизмов:

KH2PO4 – 0,4 г/л;

K2HPO4 – 0,1 г/л;

MgSO4·7H2O – 0,2 г/л;

NaCl – 0,1 г/л;

Дрожжевой экстракт – 50 мг/л;

Глюкоза – 5 г/л.

После культивирования микроорганизмов культуральные жидкости были центрифугированы в течение 10 минут при 9000g, ресуспензированы в 0,1 М трис-HCl буфере (рН = 7,5) и вновь центрифугированы. Затем клетки были ресуспензированы в 600 мкл 0,1 М трис-HCl буфере (рН = 8,5).

К приготовленной суспензии было добавлено 30 мкл толуола, и клетки были разрушены путем интенсивного встряхивания смеси в течение 1 минуты.

Затем к 100 мкл клеточных экстрактов было добавлено 10 мкл 0,5 М АЦК, 100 мкл 0,1 М трис-HCl буфера (рН = 8.5), и реакционная смесь инкубировалась в течение 30 минут при температуре 30оС.

Реакция была остановлена добавлением 1 мл 0,56 М HCl, после чего смесь центрифугировалась в течение 5 минут при 14000g.