Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

№ штамма	s ИМК	s ИКК	s ИУК	ИМК, нг/мл	ИКК, нг/мл	ИУК, нг/мл	ИМК+ ИКК+ ИУК, нг/мл
3	5507205	3621342	87965148	133,3	1477,5	874,4	2485,2
7	142194628	5499558	300159765	3441,1	2243,8	2983,6	8668,5
14	44866130	3464215	30090478	1085,8	1413,4	299,1	2798,3
24	6429752	-	7595573	155,6	-	75,5	231,1
30	25577146	2626492	26488684	619,0	1071,6	263,3	1953,9

 

По результатам проведенного эксперимента видно, что штаммы №3, №14 и №30 наиболее активно продуцируют ИКК, в отличие от штамма №24, который ИКК не продуцирует, штамм №7 наиболее активно продуцируют ИМК, а штамм №24 – ИМК, нежели основной фитогормон ИУК. Штамм №7 наиболее активно продуцирует каждый из трех идентифицированных ауксинов. По количеству всех продуцируемых фитогормонов штаммы исследуемых микроорганизмов располагаются в следующей последовательности, начиная с наиболее активного продуцента: №7, №14, №3, №30, №24.

 

3.3.3 Результаты опыта  по выявлению АЦК-утилизирующих  микроорганизмов и активности  продуцируемого ими фермента  АЦК дезаминазы

Для выявления наиболее активных АЦК-утилизирующих бактерий по окончании культивирования была проведена сравнительная визуальная оценка интенсивности и особенности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на разных питательных средах.

Оценка производилась на 5е сутки культивирования микроорганизмов.

Так как на среде без внесения источников азота наблюдался незначительный рост биомассы большинства из 11 исследуемых микроорганизмов, то предполагается, что минимальное количество азота попало в питательную среду из посторонних источников, например с внесением некоторых компонентов питания, в меньшей вероятности рост микроорганизмов на голодной среде объясняется их азотфиксирующими способностями.  

Из 11 исследуемых штаммов микроорганизмов штаммы №24 и №25 проявили более интенсивный рост на среде с добавлением АЦК в качестве источника азота, по сравнению с ростом на положительном и отрицательном контроле. Отсутствие роста наблюдалось у штаммов №16, №23, №26 и №29.

По результатам данного эксперимента было отобрано 2 штамма микроорганизмов обладающих наиболее активной АЦК-утилизирующей способностью: №24 и №25.  Они подвергались дальнейшему исследованию на предмет изучения активности продуцируемого этими бактериями фермента АЦК дезаминазы, разлагающего АЦК до α-кетобутирата и аммония.

Активность фермента АЦК дезаминазы определяли биохимическим методом Салеха и Глика. Количество α-кетобутирата, который образовывается при расщеплении бактериями АЦК, определяли спектрофотометрически при длине волны λ = 540 нм.

Оптическая плотность реакционной смеси штамма №24 D540 = 0,71

Оптическая плотность реакционной смеси штамма №25 D540 = 0,85

По численным значениям оптической плотности с помощью калибровочного графика была найдена концентрация α-кетобутирата (Сα-кетобутират) в каждом из исследуемых образцов.

Штамм №24: Сα-кетобутират = 0,69±0,02 мкмоль/мл;

Штамм №25: Сα-кетобутират = 0,79±0,05 мкмоль/мл.

По результатам проведенного опыта штамм №25 является наиболее активным продуцентом АЦК дезаминазы из всех 11 исследуемых штаммов микроорганизмов.

 

 

3.3.4 Результаты опыта  по определению способности микроорганизмов  разлагать труднодоступные фосфаты

Для определения способности разлагать труднодоступные фосфаты и их ингибирующего действия на рост и развитие микроорганизмов была проведена визуальная сравнительная оценка прироста биомассы бактерий, выросших на среде с добавлением легкодоступного источника фосфора, и прироста биомассы бактерий, выросших на среде с труднодоступными фосфатами.

Если прирост биомассы бактерий, выросших на среде с добавлением труднодоступных фосфатов (фосфат и фитат Са), более интенсивен, чем прирост биомассы на среде с легкодоступным фосфатом (K2HPO4), то для этих бактерий фосфат и фитат Са не оказывают ингибирующего действия на их рост и развитие.

Разница между интенсивностью роста биомассы бактерий, культивированных на среде с добавлением K2HPO4, и интенсивностью роста бактерий, культивированных на среде с добавлением фосфата и фитата Са, в среднем была незначительной.

Штаммы микроорганизмов с более интенсивным ростом на среде с труднодоступными фосфатами, по сравнению с ростом на среде с добавлением  K2HPO4: №7, №24, №27, №30. Остальные штаммы проявляли меньшую интенсивность роста, по сравнению с ростом на среде с добавлением  K2HPO4, отсутствие роста наблюдалось у штаммов №3,№16,№23, №29.

По результатам визуального сравнения интенсивности роста микроорганизмов на разных средах можно сделать вывод, что у штаммов №7, №24, №27 и №30 трудноразлагаемые фосфаты не оказывают ингибирующего действия на их рост и развитие.

Для выявления штаммов микроорганизмов, отличающихся наиболее активной способностью растворять труднодоступные фосфаты, сравнивалась площадь зон просветления на питательных средах вокруг колоний бактерий выросших на 7е сутки культивирования.

На чашках Петри фиксировались диаметры зон просветления на питательной среде с добавлением Ca3(PO4)2 (d1) и на питательной среде с добавлением фитата Са (d2).

 

 

 

 

 

 

Таблица 7 – Диаметр зон просветления на питательных средах

№ штамма	d1, мм	d2, мм
3	–	–
7	7,6	5,8
14	4,3	–
16	–	–
23	–	–
24	10,2	9,4
25	6,4	–
26	–	–
27	5,1	–
29	–	–
30	7,4	5,9

 

Сравнивая численные значения d1 и d2 можно сделать вывод, что фитат Са – более труднодоступное соединение для микроорганизмов, чем Ca3(PO4)2.

Так как наибольшая площадь зоны просветления соответствует наилучшей способности к разложению труднодоступных фосфатов, то из 11 исследуемых штаммов микроорганизмов можно выделить 3 штамма, обладающих способностью к разложению труднодоступных фосфатов: №24, №7 и №30.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4 Выводы по работе

 

1. По результатам опыта по выявлению углеводородокисляющей способности из 30 исследуемых штаммов микроорганизмов было отобрано 11 штаммов отличающихся наиболее активной углеводородокисляющей способностью, а именно: №25 (Rhodococcus sp. 4n44), №16 (Micrococcus luteus 220), №7 (Rhodococcus  erythropolis 401), №30 (Pseudomonas Aeruginosa 188), №23 (Bacillus pumilus 128), №3 (Rhodococcus fascians 394), №27 (Arthrobacter sp. D12str), №14 (Bacillus subtilis 440), №26 (Variovorax paradoxus 5p3), №29 (Вacillus subtilis niger 120), №24 (Variovorax paradoxus 5с2). Способность к биодеструкции углеводородов нефти была подтверждена экспериментальными данными выражающими убыль углеводородного субстрата из среды.

2. По результатам опыта по выявлению способности к продукции фитогормонов ауксинов наилучшие результаты показали штаммы №3 (Rhodococcus fascians 394), №7 (Rhodococcus  erythropolis 401), №14 (Bacillus subtilis 440), №24 (Variovorax paradoxus 5с2), №30 (Pseudomonas Aeruginosa 188). Наилучшую продукцию ауксинов выявил штамм №7 (Rhodococcus  erythropolis 401).

3. По результатам численных значений опыта на выявление АЦК дезаминазной активности наилучшим образом проявили себя штаммы №24 (Variovorax paradoxus 5с2) и №25 (Rhodococcus sp. 4n44).

4. При выявлении штаммов микроорганизмов обладающих способностью к разложению труднодоступных фосфатов были отобраны 3 из 11 исследуемых образцов: №7 (Rhodococcus  erythropolis 401), №24 (Variovorax paradoxus 5с2), №30 (Pseudomonas Aeruginosa 188).

По результатам экспериментальной части всей исследовательской работы предоставляется возможность создания консорциума штаммов бактерий, обладающих несколькими или одним из ростстимулирующих свойств и углеводородокисляющей активностью, которые важны для разработки новых технологий фиторемедиации нефтезагрязненных почв, а именно: штаммы №7 (Rhodococcus  erythropolis 401), №24 (Variovorax paradoxus 5с2) и №30 (Pseudomonas aeruginosa 188).

Считаю целесообразным проведение вегетационного опыта для определения эффективности выбранного консорциума штаммов при фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

 

1. Шаркова, С.Ю. Агрохимические свойства серых лесных почв при загрязнении их нефтью / С.Ю. Шаркова Е.В. Надежкина / Плодородие, 2008.- №4.- 45с.
2. Вальков, В.Ф. Экология почв: Учебное пособие для студентов вузов Часть 3. Загрязнение почв / В.Ф. Вальков, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников / Ростов-на-Дону: УПЛ РГУ, 2004. - 54 с.
3. Воеводина, Л.А. О биологических методах мелиорации земель. / Л.А. Воеводина, О.В. Воеводин // Вестник государственного аграрного университета, Кубанский государственный аграрный университет, 2005. - № 13. - с. 71-77.
4. Емельянова, Е.К. Биорекультивация загрязненных нефтью объектов в Тюменской области / Е.К. Емельянова // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина, 2010. - Т. 8, № 4, с. 155-161
5. Гриценко, А.И. Экология. Нефть и газ / А.И. Гриценко, Г.С. Акопов, В.М. Максимов. - М.: Наука, 1997.-598 с.
6. Восстановление нефтезагрязнённых почвенных экосистем / Под ред. М.А. Глазковской.- М. Наука, 1988.- 264 с.
7. Шамаева, А.А. Исследование процессов биоремедиации почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биол.  Наук: 14.11.2007 / Башкирский гос. унив-т.- Уфа.- 2007.
8. Панов, Г.Е. Охрана окружающей среды на предприятиях нефтяной и газовой промышленности / Г.Е. Панов, Л.Ф. Петряшин, Г.Н. Лысяный. - М.: Недра, 1986.- 244 с.
9. Проскуряков, В.А. Химия нефти и газа / В.А. Проскуряков.- СПб.: Химия, 1995. – с.448.
10. Андреева, И.И. Ботаника: учеб для с/х вузов / И.И. Андреева, Л.С. Родман.– М.: Колос, 2005. – 528с.
11. Саксонов, М.А. Экологический мониторинг нефтегазовой отрасли / М.А. Саксонов, А.Д. Абалаков, Л.В. Данько, О.А. Бархатова, А.Э. Балаян, Д.И. Стом // Физико-химические и биологические методы. - Иркутск: Иркут. Ун-т, 2005.-114 с.
12. Пиковский, Ю.И. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами / Ю.И. Пиковский, А.Н. Геннадиев, С.С. Чернянский, Г.Н. Сахаров // Почвоведение.-№ 9.-2003.-с.1132-1140.
13. Колесниченко, А.В. Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах / А.В. Колесниченко, А.И. Марченко, Т.П. Побежимова, В.В. Зыкова.- Москва: «Промэкобезопасность», 2004. - 194 с.
14. Джамбетова, П.М. Влияние нефтезагрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова, М.Н. Ситников // Экологическая генетика [электронный ресурс]: Рецензируемый научно-практический журнал.- СПб.- 2005. <http://gene-on-gene.narod.ru/arkhiv/Issues.htm>
15. Мазунина, Л.Е. Особенности анатомии и морфологии растений в условиях нефтяного загрязнения / Л.Е. Мазунина М. : Изд-во ЛКИ, 2008. - 336 с.
16. Бочарникова, Е.Д. Влияние нефтяного загрязнения на свойства серо-бурых почв Апшерона и серых лесных почв Башкирии / Е.Д Бочарникова // Автореф. Дис. … канд. биол. наук.- М.: 1990.-16 с.
17. Киреева, Н.А. Рост и развитие растений яровой пшеницы на нефтезагрязненных почвах и при биоремедиации / Н.А. Киреева, А.М. Мифтахова, Г.М. Салахова // Агрохимия.- 2006.- №1.- с.85-90.
18. Левин, С.В. Эколого-микробиологическое нормирование содержания нефти в почве / С.В. Левин, Э.М. Халимов, В.С. Гузев // Токсикологический вестник.–1995.- №1.- с. 11-15.
19. Мазунина, Л.Е. Особенности анатомии и морфологии растений в условиях нефтяного загрязнения <http://shmain.ru/nauchnye-stati/mazunina-l-e-osobennosti-anatomii-i-morfologii-rastenij-v-usloviyax-neftyanogo-zagryazneniya.html>(18.02.2010).
20. Чупахина, Г.Н. Адаптация растений к нефтяному загрязнению / Г.Н. Чупахина, П.В. Масленников // Экология.- 2004.- №5.-с.330-335.
21. Иерусалимский, Н.Д. Исследование микрофлоры сточных вод нефтеперераба-тывающих предприятий / Н.Д. Иерусалимский, Е.А. Андреева, Е.Л. Гришанкова, Е.Л. Головлев, В.В. Дорохов, Л.Н. Жукова // Прикладная биохимия и микробиология. – 1965.- № 2.-с.163-166.
22. Киреева, Н.А. Микробиологическая оценка почвы, загрязненной нефтяными углеводородами / Н.А. Киреева // Баш. Хим. ж.-1995.-2, № 3-4.-с. 65-68.
23. Киреева, Н.А. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицетов / Н.А. Киреева, Н.Ф Галимзянова // Почвоведение, 1995.- №2,- с.211-216.
24. Бабаев,  Э.Р.,  Преобразование  нефти  в  процессе  её  микробиологической деградации в почве // Э.Р. Бабаев, Мовсумзаде  М.Э. / Башкирский химический журнал, 2009. – Т.16. - №3. – С. 80-87.
25. Скрябин, Г.К., Головлёва Л.А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе / Г.К. Скрябин, Л.А. Головлёва М.:Наука, 1976. – 332 с.
26. Crawford R.L., Frick T.D. Purification and properties of gentisate-l,2-dioxygenase from Moraxella osloensis // Journal of Bacteriology. - 1975. - Vol. 121. - P. 794-799.
27. Gasellas, M., Grifoll M., Sebate J., Solanas A.M. Isolation and characterization of a fluorenone-

degrading bacterial strain and its role in synergistic degradation of fluorene by a consortium // Canadian journal of Microbiology. - 1998. - Vol. 44. - P. - 734-742.

28. Grifoll, М., Gasellas М., Bayona J., Solanas A.M. Isolation and characterization of a fluorenedegrading bacterium: identification of ring oxidation and ring fission products // Applied and Environmental Microbiology. - 1992. – Vol. 58. - P. 2910-2917.
29. Kastner, M., Breuer-Jammali M., Mahro H. Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarbon-contaminated soil sites able to mineralize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) //Applied Microbiology and Biotechnology. - 1994. - Vol. 41. - P. 267-273.
30. Kiyohara, H., Nagao K., Nomi R. Degradation of phenanthrene through o-phthalic acid bv an

Aeromonas sp. // Agricultural and biological chemistry. - 1976. - Vol.40. - P. 1075-1082.

31. Kiyohara H., Nagao K. The catabolism of phenantrene and naphthalene by bacteria// Journal of

General Microbiology. - 1978. - Vol. 105. - P. 69-75.

32. Kiyohara H., Nagdd K., Yana K. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid

hydrocarbons on agar plates // Applied and Environmental Microbiology. - 1982. - Vol. 43. - P. 454 457.

33. Samanta S.K., Singh О.V. Polycyclic aromatic hydrocarbons: environmental pollution and

bioremediation // Trends in Biotechnology. - 2002. - Vol. 20. - P. 243-248.

34. Sukplanga P., Thongmeea A., Velaa G. Roland. Degradation of Linseed Oil Vapors by Soil Bacteria in Trickling Biofilters // Bioremediation Journal. - 1999. -Vol. 3. - P. 189-200.\
35. Vetrova A.A., Ovchinnikova A.A., Puntus I.F, Filonov A.E., Boronin A.M. An enhanced biodegradation of crude oil by Psedomonas plasmid-bearing strains in model soil systems // Applied Biochemistry andтMicrobiology. - 2010. -Vol. 46. - P. 719-725.
36. Yamada К., Horiguchi S., Takahashi J. Studies on the utilization of hydrocarbons by microorganisms// Agricultural and biological chemistry. - 1965. - Vol. 29. - P. 943-948.
37. Crawford R.L., Frick T.D. Purification and properties of gentisate-l,2-dioxygenase from Moraxella osloensis // Journal of Bacteriology. - 1975. - Vol. 121. - P. 794-799.
38. Cerniglia СЕ. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons //Biodegradation. - 1992. –Vol. 3.- P. 351-368.
39. Bar-Ness E., Chen Y., Hadar Y. Siderophores of Pseudomonas putida as an iron source for dicot and monocot plants. Plant and Soil, 1991, 130: 231-241.
40. Becker D., Stanke R., Fendrik I. Expression of the NH4+-transporter gene LEAMT1:2 is induced in tomato roots upon association with N2-fixing bacteria. Planta, 2002, 215: 424-429.
41. Mantelin S., Touraine B. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake. J. Exp. Bot., 2004, 55: 27-34.
42. Czarny J.C., Grichko V.P., Glick B.R. Genetic modulation of ethylene biosynthesis and signaling in plants. Biotech. Adv., 2006, 24: 410-419.
43. Glick B.R., Jacobson C.B., Schwarze M.M.K. 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acideaminase mutants of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation. Can. J. Microbiol., 1994, 40: 911-915.
44. Belimov A.A., Dodd I.C.,  Hontzeas N. Rhizosphere bacteria containing ACC deaminase increase yield of plants grown in drying soil via both local and systemic hormone signaling. New Phytol., 2009, 181: 413-423.
45. Glick B.R. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment. Biotech. Adv., 2003, 21: 383-393. 
46. Safronova V.I., Stepanok V.V., Engqvist G.L. Root-associated bacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated in cadmium supplemented soil. Biol. Fertil. Soils, 2006, 42: 267-272.
47. Belimov A.A., Wenzel W.W. The role of rhizosphere microorganisms in heavy metal tolerance of higher plants. Aspe. Appl. Biol., 2009, 98: 81-90.
48. Belimov A.A., Dodd I.C., Safronova V.I. e.a. ACC deaminase-containing rhizobacteria improve vegetative development and yield of potato plants grown under water-limited conditions. Aspe. Appl. Biol., 2009, 98: 163-169. 
49. Mayak S., Tirosh T., Glick B.R. Plant growth-promoting bacteria that confer resistance in tomato to salt stress. Plant Physiol. Biochem., 2004, 42: 565-572.
50. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Curr. Opin. Plant Biol., 2001, 4: 343-350. 
51. Duffy B., Keel C., Defago G. Potential role of pathogen signaling in multitrophic plant-microbe interactions involved in disease protection. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70: 1836-1842.
52. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M.,  Pieterse C.M.J. Systemic resistance induced by