Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

Изменения микробиологических параметров почвы первыми рассматриваются как значимые экологические нарушения. Они зафиксированы при концентрациях нефти более 1-5 мл/кг в зависимости от типа почвы [23].

1.3 Микробная деградация углеводородов  нефти

1.3.1 Микроорганизмы – деструкторы нефти и нефтепродуктов

Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным различными систематическими группами. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая и ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют большой практический интерес.

Микроорганизмы, использующие  углеводороды, широко  распространены  в  природе. Активные формы микроорганизмов выделяются из разнообразных водных и почвенных экосистем, особенно загрязнённых углеводородами или нефтью, а также из микрофлоры нефти и пластовых вод нефтяных месторождений. Были описаны 22 рода бактерий, 31 род микроскопических грибов и в том числе 19 родов дрожжей, выделенных  из  почвенных  экосистем, способных  к  биодеградации  различных нефтяных  углеводородов. Из  морской  среды  обитания  выделено 25 родов  бактерий  и 27 родов углеводородокисляющих микроскопических грибов. В их числе бактерии родов Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Desulfovibrio, Eneribacer, Escherichia, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Pseudomonas, Sarcina, Serratia, Spirillum, Streptomyces, Thiobacillus, Vibrio; мицелиальные  грибы родов Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trichoderma; дрожжи Candida, Debaryomyces, Endomyces, Endomycopsis, Hansenula, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis, Trichosporon; цианобактерии Agmenellum, Aphanocapsa, Lyngbya, Microcoleus, Oscillatoria, Phormidium, Plectonema [24].

Как видно, углеводородокисляющая группа микроорганизмов природного происхождения таксономически очень разнообразна. Наиболее активные бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Из дрожжей выделяют род Candida и Torulopsis [25].

Постоянными и доминирующими компонентами естественных биоценозов нефтяных загрязнений являются родококки, их основная экологическая функция – аккумуляция газообразных н-алканов, жидких углеводородов нефти и трансформация их в биомассу. Бактерии этого рода отличаются высокой жизнестойкостью при действии неблагоприятных факторов – низкой температуры, солнечного ультрафиолета, длительного отсутствия питательных веществ. Естественная нефтеокисляющая микрофлора нефтезагрязненной тундровой почвы представлена главным образом бактериями R. Еrythropolis. В связи с этим понятен интерес к родококкам – деструкторам нефти [24].

В настоящее время активно ведётся поиск микроорганизмов, разрушающих нефть, в особенности при низких температурах. Т. В. Коронелли провел скрининг коллекции углеводородокисляющих бактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus на агаризованной среде с парафином при температуре 6°С с целью выбора штамма, сохраняющего углеводородокисляющую активность при низких температурах. Отобранные таким образом 17 штаммов выращивали в жидкой среде с нефтью при температуре 8°С. Через 14 суток определяли концентрацию нефтяных углеводородов методом ИК-спектроскопии. Оказалось, что 12 штаммов использовали от 13 до 36% внесенной нефти, два штамма – 5-6%, а три были неэффективными. Все 12 штаммов являлись представителями рода Rhodococcus: 11 штаммов принадлежали к виду R. Еrythropolis, один – к виду R. Мaris [25].

Немалый интерес представляют спорообразующие бактерии, так как они наиболее устойчивы к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды [26].

Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородных загрязнений должен производиться с учетом ряда требований. При поиске микроорганизма-деструктора необходимо учитывать, что вносимая в почву микробная биомасса не должна быть чужеродной для почвенной микрофлоры. Еще одним важным требованием к вносимым в почву микроорганизмам является их непатогенность. В связи с тем, что технология микробиологической очистки загрязненных почв предусматривает аэробные условия, необходимо вести выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Микробные клетки могут подвергаться воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, следовательно, микроорганизм-деструктор должен обладать высокой жизнестойкостью [27].

 

1.3.2 Процесс микробиологического окисления углеводородов нефти

Микробиологические превращения углеводородов представляют собой особую область из-за  некоторых  особенностей  этих  процессов. Их  специфика  обусловлена  своеобразием углеводородов как химических соединений с предельной восстановленностью и связанными с этим гидрофобными свойствами. Оказалось, что гидрофобность углеводородной молекулы имеет большое значение для химизма микробиологического окисления этих соединений, их транспорта в микробную клетку, динамики роста культур, их физиологии, многих аспектов технологии  процессов, связанных  с  применением  субстратов  углеводородной  природы.

Все  реакции  микробиологического  превращения  углеводородов  являются окислительными. Предельная восстановленность этих веществ делает необходимым для их окисления  присутствие  кислорода. Гидрофобный  характер  молекулы  является  причиной того, что процессы окисления осуществляются оксигеназами, в отличие от окисления более гидрофильных  веществ, происходящего  под  действием  дегидрогеназ. Гидрофобность углеводородных  субстратов  и  их  плохая  растворимость  в  воде  определяют  способы транспорта веществ в клетку.

Характерной особенностью процесса ассимиляции углеводородов в качестве источника углерода  является  часто  встречающееся  накопление  промежуточных  продуктов  в культуральной  среде  микроорганизмов, растущих  за  счёт  таких  субстратов [28].

Окисление углеводородов большинством известных микроорганизмов осуществляется с  помощью  адаптивных  энзимов (ферментов). Этот  факт  установлен  многочисленными экспериментами по окислению углеводородов клетками микроорганизмов, выращенных на неуглеводородных  субстратах.

1.3.2.1 Пути поступления углеводородов в клетки микроорганизмов

Имеющиеся  разнообразные  данные  о поступлении  углеводородов  в  клетки  микроорганизмов, локализации углеводородокисляющих  ферментов  и  образующихся  продуктов  не  оставляют  сомнений в том, что  углеводороды  окисляются  внутриклеточно. Отсюда  вытекает  необходимость объяснить поступление нерастворимого в воде субстрата в клетку.

Различают следующие виды транспорта углеводородов в клетки микроорганизмов:

- пассивный перенос:

а) простая диффузия – неспецифическое поступление веществ в клетку, при котором различные соединения проникают в клетку, не взаимодействуя с каким-либо переносчиком;

б) облегчённая  диффузия – специфический  процесс, при  котором  переносимое вещество  обратимо  связывается  с  переносчиком, находящимся  в  мембране, и  поступает  в клетку в виде субстрат-белкового комплекса. При этом скорость поступления веществ равна скорости его выхода из клетки.

Оба  эти  процесса  не  требуют  энергии, и  скорость  их  зависит  от  концентрации субстрата в среде.

- активный перенос – вещество поступает в клетку против градиента концентрации в среде; процесс  требует  затрат  энергии  и  происходит  с  помощью  специфических  белков-переносчиков (пермеаз).

Дальнейшие  ограничения  связаны  с  растворимостью  субстрата  в  воде. Поступление субстрата в микробную клетку может осуществляться либо из состояния истинного раствора, либо  при  непосредственном  контакте  его  с  клеткой.

Процесс  поглощения  определяется  как  активный  транспорт  в  соответствии  со следующими параметрами:

- специфичность  по  отношению  к  субстрату; на  наружной  поверхности  мембраны образуется комплекс переносчик — субстрат;

-   потребность в метаболической энергии; переносчик обладает высоким сродством к субстрату, если он обращен к внешней поверхности мембраны, и низким сродством к нему, если  обращен  к ее  внутренней  поверхности. На  эти  изменения  переносчика  и  расходуется энергия;

- транспорт  соответствующего  субстрата  против  градиента  концентрации; это происходит  за  счет  изменения  сродства  переносчика  к  субстрату  при  переходе  снаружи внутрь;

- освобождение  в  цитоплазму  немодифицированного  субстрата (в  отличие  от переноса групп).

Только  низкомолекулярные  жидкие  углеводороды  от C5 до C11, а  также  некоторые ароматические  углеводороды  могут  незначительно  растворяться  в  воде, более высокомолекулярные  гомологи  практически  нерастворимы [29].

 

1.3.2.2 Микробиологическое окисление углеводородов нефти и нефтепродуктов

 

Окисление нормальных парафинов

Пути  окисления  нормальных  парафинов  микроорганизмами, использующими  эти соединения  в  качестве  источников  углерода  и  энергии, изучены  достаточно  подробно.

В преобладающем большинстве случаев в результате первичной ферментативной атаки молекулы н-парафина  происходит  окисление  терминального  атома  углерода. Первыми стабильными  продуктами  окисления  углеводородов  являются  первичные  спирты.

Следующий  этап  составляют  обычные  биологические  превращения  спирта  в  альдегид  и альдегида  в  кислоту. Общая  схема  реакций  выглядит  следующим  образом:

R-CH2-CH3+ [O] → R-CH2-CH2OH - 2H → R-CH2-CHO - 2H + HOH → (1)  R-CH2-COOH

Дальнейший  механизм  усвоения  жирных  кислот, возникающих  при  окислении углеводородов, протекает  путем  β-окисления, заключающегося  в  последовательном отщеплении  двууглеродных  фрагментов  в  виде  активного  ацетата, поступающего  в  цикл трикарбоновых кислот [30].

H.B. Lukins и J.W. Foster установили, что некоторые микобактерии метаболизируют н-алканы через метилкетоны с промежуточным образованием перекиси и вторичного спирта [31].

Дальнейшее окисление кетонов изучено пока  недостаточно.

На  основании  работ F.W. Forney и A.J. Markovetz деградация  тридекана  культурой Pseudomonas aeruginosa представляется следующим образом [32]:

 

СН3(СН2)11СН3 → СН3(СН2)10СНОНСН3 → СН3(СН2)10СОСН3→ СН3(СН2)9СН2ОСОСН3  → СН3(СН2)9СН2ОН + СН3СООН                    

                                              ↓                                                                (2)

                                   СН3(СН2)9СООН.

 

Окисление алкенов

Микробиологическое  окисление  алкенов  может  включать  следующие  реакции:

а) окисление  метильной  группы  с  образованием  ненасыщенных  кислот; б) образование эпоксидов  по  двойной  связи; в) образование  диолов. Ненасыщенные  углеводороды  могут окисляться одновременно и по метильной концевой группе и по двойной связи молекулы.

Еще  в 60-е  гг. Стюарт  с  сотрудниками  показали, что  эфирообразующие  бактерии Micrococcus cerificans окисляли метильную группу алкенов-1, не затрагивая двойную связь молекулы. Впоследствии детальные исследования, проведенные Ван-дер-Линденом и Тийссе выявили и другой путь окисления алкенов, ведущий к образованию эпоксидов, диолов, α-оксикислот и ненасыщенных кислот [33].

Изучая  окисление  тетрадецена  культурой Pseudomonas aeruginosa, A.J. Markovetz с сотрудниками обнаружили оба пути окисления. Ими были выделены и идентифицированы тетрадеценовая-13 кислота и тетрадеканол-2. Это свидетельствовало о том, что и метильная группа  и  терминальная  двойная  связь  подвергались  атаке  этой  культурой. Позже  были обнаружены  оба  пути  окисления  гексадецена-1 и  октадецена-1 культурой Micrococcus cerificans [34].

На основании этих работ можно дать схему  реакций окисления алкенов бактериями, представленную на рисунке 1:

Рисунок 1 – Схема реакций окисления алкенов бактериями

 

Окисление циклоалканов

Описано несколько примеров полной деградации циклопарафинов и их производных, причем  показано, что  деградации  циклоалканов  нередко  предшествует  их  ароматизация.

Впервые микробиологическая трансформация циклопарафинов описана J.S. Ooyama и J.W. Foster. Микроорганизм Mycobacterium vaccae, способный  усваивать  изоалканы, в частности 2-метилбутан, окислял  циклические  алканы  до  соответствующих  кетонов суспензиями отмытых клеток.

Гомологи  ряда  циклопарафинов  от  С3 до С8  превращались  в  соответствующие цикломонокетоны. Окисление  циклоалканов  до циклокетонов, по-видимому, происходило через образование цикломоноспиртов.

Детально  исследовалось  окисление  циклоалканов G.S. Fonken с  сотрудниками. Была изучена  большая  группа  грибов  и  бактерий  на  способность  окислять  циклопентаны  при росте  на  различных  субстратах: пептоне, декстрозе, солодовом  и  кукурузном  экстрактах.

Авторам  удалось  с  помощью  этих  организмов  провести  окисление  циклогексана, фенилциклогексана, циклогексилсульфонов, циклопентилсульфонов  и  других  до соответствующих  оксипроизводных. На рисунке 2 и 3 приводятся типичные примеры окислительных трансформаций циклоалканов [35]:

 

Рисунок 2 – Схема реакций окисления циклопропана, циклогексана

и бициклогексила

 

 

Рисунок 3 – Схема реакций окисления н-бутилциклогексана,

этилциклогексана и метилциклопентана

 

 

 

Деградация фенантрена

К настоящему времени описано 2 различных пути  деградации  фенантрена, которые  представлены  на  рисунке 4. Сначала  фенантрен  в результате  последовательных  реакций  трансформируется  до 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты. Дальнейшие  биохимические  пути  деградации  этого  соединения  могут  быть различны: 1-гидрокси-2-нафтойная  кислота  метаболизируется  либо  через  салицилат  и катехол, либо  через  образование о-фталата  и  прокатехата. Катехол  и  протокатехат  далее расщепляется  по  орто- или  мета-пути  до  интермедиатов  цикла  Кребса.