Селекция и характеристика штаммов углеводородокисляющих и антистрессовых бактерий для повышения адаптационного потенциала растений

По окончании центрифугирования к 500 мкл супернатанта было добавлено 400 мкл 0,56 М HCl и 150 мкл 0,2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М NaOH, и реакционная смесь вновь инкубировалась в течение 30 минут при температуре 30оС.

После инкубации был добавлен 1 мл 2 М NaOH.

Активность фермента АЦК дезаминазы определяли по количеству α-кетобутирата, который образовывается при расщеплении бактериями АЦК, спектрофотометрически при длине волны λ = 540 нм.

Для определения активности АЦК дезаминазы использовался калибровочный график зависимости концентрации α-кетобутирата от оптической плотности реакционной смеси.

 

3.2.4 Определение способности к разложению  труднодоступных фосфатов

Изучение способности бактерий к разложению труднодоступных фосфатов проводили, культивируя микроорганизмы на агаризованной питательной среде, содержащей в качестве труднодоступных растениям соединений трехзамещенный фосфат кальция (Ca3(PO4)2) и фитат Ca, которые в существенной мере снижают биодоступность фосфора. Проявление способности характеризуется зонами просветления на питательных средах вокруг колоний выросших микроорганизмов.

Состав питательной среды для культивирования отобранных штаммов микроорганизмов:

Пептон – 5 г/л;

Гидролизат козеина – 5 г/л;

MgSO4·7H2O – 1,5 г/л;

Агар – 15 г/л.

На данной выше основе было приготовлено 3 варианта питательной среды:

1. С добавлением 3 г/л Ca3(PO4)2 в качестве труднодоступного фосфата.
2. С добавлением 3 г/л фитата Са в качестве труднодоступного фосфата.
3. С добавлением 1,5 г/л K2HPO4 в качестве легкодоступного фосфата.

Для засева культур на твердую питательную среду использовался репликаторный метод. В 11 ячеек репликатора было добавлено по 150 мкл физиологического раствора с ресуспензированными в нем клетками. Для приготовления посевного материала использовалась 3-х суточная культура.

Культивирование микроорганизмов на всех средах проводилось в термостате при температуре 280С.

По результатам эксперимента можно было визуально сравнить рост биомассы бактерий, выросших на среде с добавлением легкодоступного источника фосфора, и бактерий, выросших на среде с труднодоступными фосфатами.

Так как среды с добавлением фосфата и фитата Са, в отличие от прозрачной среды с добавлением K2HPO4, были белесовато-мутными, то способность к растворению труднодоступных фосфатов можно было оценить по площади зон просветления на питательных средах вокруг колоний выросших микроорганизмов. Наибольшая площадь зоны просветления соответствовала наилучшей способности к разложению труднодоступных фосфатов.

Результаты эксперимента фиксировались на 7-е сутки культивирования.

 

3.3 Результаты исследования, их анализ  и обсуждение

3.3.1 Результаты опыта по определению  углеводородокисляющей активности

Прирост биомассы углеводородокисляющих бактерий.

Для определения прироста биомассы был проведен сравнительный анализ оптических плотностей культуральной жидкости исследуемых образцов на фотоэлектрическом колориметре Smart-Spec-Plus (Biorad, США).  Контролем служила культуральная жидкость бактерий выросших при тех же условиях, но употреблявших в качестве единственного источника углерода и энергии стартовое количество дрожжевого экстракта, присутствующего в среде вместо углеводородов нефти.

Показания снимались при длине волны λ=540нм.

Так как опыт проводился в двукратной повторности, численные значения для каждого исследуемого образца были усреднены.

 

Таблица 3 – Оптическая плотность культуральной жидкости исследуемых образцов

№ штамма	D540 (оптическая плотность)	D540ср.	№ штамма	D540 (оптическая плотность)	D540ср.
1	0,015	0,007	16	0,081	0,082
	-0,001			0,083
2	0,042	0,036	17	0,002	0,011
	0,030			0,020
3	0,071	0,070	18	0,031	0,024
	0,069			0,017
4	-0,024	- 0,014	19	-0,009	-0,003
	-0,004			0,003
5	0,017	0,023	20	-0,002	-0,020
	0,029			-0,038
6	0,058	0,054	21	0,038	0,031
	0,049			0,024
7	0,078	0,081	22	-0,001	0,008
	0,083			0,017
8	0,030	0,012	23	0,073	0,071
	-0,006			0,068
9	-0,013	0,001	24	0,047	0,055
	0,015			0,063
10	0,023	0,010	25	0,085	0,086
	-0,003			0,087
11	0,037	0,025	26	0,061	0,064
	0,013			0,066
12	0,028	0,013	27	0,067	0,070
	-0,002			0,073
13	0,006	-0,008	28	0,023	0,015
	-0,022			0,007
14	0,059	0,065	29	0,055	0,060
	0,070			0,064
15	0,036	0,019	30	0,072	0,079
	0,002			0,085

 

 

Наибольшая оптическая плотность культуральной жидкости соответствует наибольшему приросту биомассы и характеризует то, что углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и энергии, являются приемлимыми для роста и развития микроорганизмов. 

По результатам эксперимента из 30 исследуемых образцов можно выделить 11 штаммов микроорганизмов, которые наилучшим образом используют углеводороды нефти в качестве источника питания и энергии, а именно: №25, №16, №7, №30, №23, №3, №27, №14, №26, №29, №24. Номера штаммов микроорганизмов указаны в порядке убывания оптической плотности их культуральной жидкости.

Убыль углеводородного субстрата из среды.

Выявленный прирост биомассы у 11 из 30 штаммов исследуемых микроорганизмов по результатам проведенного опыта дает основания полагать, что выбранные штаммы активно использовали углеводороды нефти для собственного роста и развития и, как следствие, обладают деструктивным потенциалом.

Для подтверждения углеводородокисляющей активности выбранных штаммов была зафиксирована убыль углеводородного субстрата из среды гравиметрическим методом.

Для определения массы нефти, оставшейся по окончании культивирования, вычислялась разница между массой предварительно взвешенной пустой кюветы и массой этой же кюветы, содержащей экстрагированную нефть.

M1 = m2 - m1, где                                                                                            (1)           

m1 – масса пустой кюветы, [мг];

m2 – масса кюветы, содержащей экстрагированную нефть, [мг];

M1 – масса нефти, оставшейся по окончании культивирования, [мг].

Так как опыт проводился в двукратной повторности, численные значения были усреднены для каждого исследуемого штамма.

Для определения количества разложившейся нефти вычислялась разница между массой нефти из контрольной пробирки и массой нефти, оставшейся по окончании культивирования.

M2 = Мк - M1, где                                                                                           (2)                        

Мк – масса нефти из контрольной пробирки, [мг];

Мк = m2 - m1 = 103,9 – 81,5 = 22,4 мг.

M2 – масса разложившейся нефти, [мг].

Деструктивная способность исследуемых штаммов микроорганизмов выражалась в процентах убыли углеводородного субстрата из среды - M2, %.

 

Таблица 4 – Промежуточные и итоговые данные по нахождению массы разложившейся нефти исследуемых образцов

№ штамма	m1, мг	m2, мг	M1, мг	M1ср., мг	M2, мг	M2, %
3	100,9	117,8	16,9	16,4	6,0	26,7
	99,3	115,2	15,9
7	100,6	116,0	15,4	14,3	8,1	36,2
	102,3	115,5	13,2
14	101,7	115,6	13,9	14,9	7,5	33,5
	103,5	119,3	15,8
16	99,3	116,4	17,1	17,0	5,4	24,1
	100,1	117,0	16,9
23	105,0	120,0	15,0	15,2	7,2	32,1
	100,4	115,7	15,3
24	101,9	117,4	15,5	14,3	8,1	36,2
	99,0	112,1	13,1
25	104,4	120,8	16,4	16,1	6,3	28,1
	100,8	116,5	15,7
26	102,4	116,2	13,8	14,9	7,5	33,5
	103,8	119,7	15,9
27	100,6	116,7	16,1	15,8	6,6	29,5
	101,3	116,7	15,4
29	103,7	115,4	11,7	13,8	8,6	38,4
	100,4	116,3	15,9
30	100,9	118,1	17,2	15,4	7,0	31,3
	102,8	116,5	13,7

 

 

Наибольшее значение М2 соответствует наибольшему количеству углеводородов нефти, разложившихся до СО2 и Н2О, и деструктивной способности в целом. Деструктивная способность охарактеризована у следующих штаммов микроорганизмов: №29, № 7, №24, №14, №26, №23, №30, №27, №25, №3, №16. Номера штаммов указаны в порядке убывания их углеводородокисляющей активности.

По результатам данного опыта у 11 отобранных штаммов микроорганизмов, проявляющих наибольшую интенсивность роста, была подтверждена их углеводородокисляющая активность, выраженная в процентах убыли углеводородного субстрата из среды.

 

3.3.2 Результаты опыта  по определению способности к  продуцированию ауксинов по выявлению  фитогормонов с использованием  ВЭЖХ 

 

11 отобранных  в предыдущем опыте штаммов  микроорганизмов подвергались предварительному  анализу на определение их способности к продукции фитогормонов ауксинов.

Для выявления штаммов, отличающихся наиболее интенсивной способностью к продуцированию индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) был проведен сравнительный анализ с использованием реактива Сальковского на фотоэлектрическом колориметре. Контролем для сравнительного анализа служила питательная среда без внесения микроорганизмов с добавлением того же количества реактива Сальковского. Показания снимались при длине волны λ=540нм.

 

Таблица 5 – Оптическая плотность реакционной смеси исследуемых образцов

№ штамма	D540 (оптическая плотность)
3	0,134
7	0,380
14	0,052
16	0,002
23	0,005
24	0,039
25	0,001
26	0,005
27	0,008
29	0,006
30	0,061

 

Так как наибольшее значение оптической плотности соответствует наиболее яркому окрашиванию реакционной смеси, а значит и наиболее активному продуцированию ИУК, то по результатам эксперимента было отобрано 5 штаммов микроорганизмов отличающихся наиболее активным продуцированием ИУК: №7, №3, №30, №14, №24. Номера штаммов исследуемых микроорганизмов указаны в порядке убывания их активности продуцирования ИУК.

Отобранные штаммы подвергались дальнейшему исследованию на предмет определения точного количества продуцируемого фитогормона ИУК и некоторых его производных с использованием ВЭЖХ.

По окончании разделения и идентификации ауксинов, системой UPLC была произведена обработка данных, в результате которой нами были получены диаграммы хроматографии каждого исследуемого штамма микроорганизмов, позволяющие рассчитать точное количество продуцируемого ими основного фитогормона ИУК и его производных.

 

Рисунок 8 – Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 3

 

Рисунок 9 – Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 7

 

Рисунок 10 – Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 14

 

Рисунок 11 – Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 30

 

Обозначения принятые в рис.8-11:

EU – интенсивность флуоресценции (Emission Units – единицы эмиссии);

ILA – индолил-3-молочная кислота (ИМК);

ICA – индолил-3-карбоновая кислота (ИКК);

IAA – индолил-3-уксусная кислота (ИУК).

Для определения точного количества продуцируемых штаммами фитогормонов был использован стандартный раствор с заранее известной концентрацией ауксинов. В 5 мкл стандарта содержится: ИМК – 2,5·10-6 нг; ИКК – 5·10-5 нг; ИУК – 2·10-5 нг.

Чтобы определить количество любого из трех ауксинов, содержащихся в одной единице эмиссии, нужно соотнести концентрацию ауксина стандартного раствора и площадь пика на диаграмме хроматографии этого же стандартного раствора. Как правило, эти данные так же заранее известны, таким образом:

k ИМК = 1,21·10-7;  k ИКК = 2,04·10-6;  k ИУК = 4,97·10-8, где

k ИМК – количество индолил-3-молочной кислоты в 5мкл стандартного раствора отнесенное к одной единице эмиссии;

k ИКК– количество индолил-3-карбоновой кислоты в 5мкл стандартного раствора отнесенное к одной единице эмиссии;

k ИУК – количество индолил-3-уксусной кислоты в 5мкл стандартного раствора отнесенное к одной единице эмиссии.

Зная площадь пиков на диаграммах хроматографии исследуемых штаммов микроорганизмов, можно определить точное количество продуцируемых ими ауксинов:

ИМК = k ИМК· s ИМК·200;  ИКК = k ИКК· s ИКК·200;  ИУК = k ИУК· s ИУК·200,  где                                                                                                 (3)

s ИМК, s ИКК, s ИУК – площадь пиков соответствующих ауксинов на диаграмме [EU2];

ИМК, ИКК, ИУК – количество соответствующих ауксинов исследуемого образца [нг/мл];

200 –  кратность 1 мл к 5 мкл.

 

Таблица 6 – Количество ауксинов в 1 мл культуральной жидкости исследуемых образцов