Иммунологические методы диагностики

Синтез нуклеотидов по второму  пути может происходить лишь в  том случае, когда в клетке присутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ). Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, Т и А (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были не способны усваивать Г и Т, т.е. были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, т.е. гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток.

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной  клеткой или клеткой животного  происхождения. Когда в их крови  появлялись антитела, у мышей брали  селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК) и готовили из них взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в ГАТ-среду. Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре. Плазмоцитомные клетки и их гибриды тоже погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела. Техника их получения была названа гибридомной технологией (рис. 16).

 

 

Рис. 16. Схема получения  моноклональных антител

 

 

 

Культивирование и поддержание гибридом

 

В настоящее время для получения  гибридом используют только такие линии  миеломных клеток, которые не секретируют  свои собственные иммуноглобулины. Гибридомы, полученные в результате слияния с такими вариантами, продуцируют только антитела спленоцитов. Существует много различных типов маркированных (дефектных по ГГФРТ) миеломных клеточных линий лабораторных животных (мышь, крыса) и человека. Особенностью этих линий является устойчивость к антиметаболитам (ядам) — аналогам пуриновых оснований (8-азагуанин, 6-тиогуанин и др.), которая является наследственным признаком, обусловленным генной мутацией, и связана с утратой гена ГГФРТ (табл. 19).

 

 

Таблица 2. Миеломные линии, использующиеся для получения гибридом

 

№ п/п	Клеточная линия	Общепринятое обозначение	Устойчивость
1	P3-x63/Aq8	Х6З	8-Ag*
2	Fox-NY	Fox	8-Ag*
3	NS-1/1Ag14.1	NS-1	8-Ag*
4	Sр2/О-Ag	Sp2/0	8-Ag*
5.	X63-Ag8.653	X653	8-Ag*

* Линия устойчива к 8-азагуанину.

 

Лимфоциты получают от животных, обычно мышей, которых иммунизируют специфическим  антигеном. Смесь лимфоцитов и миеломных  клеток после слияния в среде, содержащей ПЭГ, культивируют в полистироловых планшетах для тканевых культур в присутствии фидеров (фибробластов или перитонеальных макрофагов) на среде ГАТ. Через 12–17 дней гибридные клетки образуют макроскопические колонии на подстилке кормящих клеток. Супернатант каждой культуры проверяют на присутствие специфических антител. Культуры гибридом, секретирующие специфические антитела, наращивают, клонируют, замораживают и используют для изучения характеристик содержащихся в ней мАТ. Клоны гибридом, продуцирующих мАТ необходимой специфичности, вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышей для получения асцитов. 10 мл асцитической жидкости вполне достаточно для выполнения обширных исследовательских программ, поэтому клоны гибридом не поддерживают постоянно как растущую культуру, а замораживают и восстанавливают по мере надобности для наработки больших количеств мАТ.

Необходимое оборудование:

• Бокс для вирусологической работы.

• Бокс для работы с культурой клеток.

• Шкаф с вертикальным ламинарным потоком воздуха.

• СО₂-инкубатор, содержание СО₂ соответствует 5–7 %.

• Центрифуги высокоскоростные.

• Люминесцентный и инвертированный микроскопы.

• Суховоздушный и жидкостный термостат.

• Низкотемпературный холодильник (температура –20...–70 °C).

• Холодильник бытовой (+4 °C).

• Сосуды для криоконсервации (СДС-20, СДС-30).

• Центрифуга настольная лабораторная 1000–8000 об/мин.

• Магнитная мешалка.

• Многоканальные пипетки на 50–250 мкл.

• Одноканальные пипетки на 2, 10, 50 и 100 мкл.

• Планшеты для культивирования клеток 4-, 6-, 12-, 24- и 96-луночные.

• Чашки Петры полистироловые.

• Гомогенизаторы стеклянные.

• Стерильная лабораторная посуда.

 

Получение иммунных лимфоцитов

Гибридомы образуются при слиянии  устойчивых к 8-азагуанину миеломных  клеток с синтезирующими антитела В-лимфоцитами, еще не полностью дифференцированными в зрелые плазматические клетки. Поэтому все процедуры гибридизации предусматривают взятие лимфоцитов у иммунизированного животного в первые 6 дней после введения последней дозы антигена, т.е. до полной дифференциации их в плазматические клетки. Лимфоциты многих видов животных обладают способностью образовывать жизнеспособные антителопродуцирующие гибридомы при слиянии с клетками мышиной миеломы. Однако использование в качестве источника лимфоцитов мышей линии BALB/c открывает гораздо большие перспективы.

Гибридомы «мышь-мышь» более стабильны  и секретируют большие количества антител, чем межвидовые гибриды. Мышиные линии РЗ, Х653, NS-1, SP2/0, которые обычно используются для слияния, несут антигены гистосовместимости BALB/c. Образующиеся в результате слияния гибридомы при этом будут нести только BALB/c антигены гистосовместимости, что позволяет выращивать их в брюшной полости мышей этой линии. При этом продукция антител гибридомой этой линии превышает продукцию in vitro более чем в 1000 раз.

Для иммунизации мышей не обязательно  использовать высокоочищенные антигены, так как каждая полученная гибридома будет продуцировать антитела лишь к одной антигенной детерминанте (эпитопу). Тем не менее повышение степени очистки антигена увеличивает процент гибридом, синтезирующих антитела необходимой специфичности.

 

Культивирование клеток перевиваемой мышиной миеломы Sр2/0

Клетки мышиной миеломы Sp2/0 дефектны по ферменту ГГФРТ, что обусловливает  их чувствительность к среде ГАТ  и устойчивость к антиметаболиту 8-азагуанину. Иногда миеломные клетки теряют устойчивость к 8-азагуанину и приобретают способность расти и размножаться в среде ГАТ. При использовании таких реверантных клеток для гибридизации они будут расти в селективной среде, тормозить рост и маскировать наличие образовавшихся гибридом. И хотя у линии Sp2/0 очень низкий процент реверсий по сравнению с другими миеломами мышей, рекомендуется культивирование этих клеток в среде, содержащей 8-азагуанин.

Методика. Клетки миеломы культивируют при 37 °C в стеклянных матрасах на 100 или 200 мл, в среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной сыворотки теленка (ФСТ) и 15 мкг/мл 8-азагуанина. Посевная концентрация клеток 1–1,5×10⁵/мл. Обычно клетки растут довольно быстро и требуют субкультивирования раз в 2-3 дня. Удвоение клеточной популяции происходит за 15–20 часов. Субкультивирование выполняют энергичным встряхиванием матраса (для отделения прикрепившихся к стеклу клеток) и заменой 1/2 или 2/3 среды на свежую. Ежемесячно культуры необходимо переводить в чистые культуральные матрасы.

Для стимуляции пролиферативной активности клетки миеломы в течение недели перед слиянием необходимо субкультивировать ежедневно или раз в два дня. За 24 часа до гибридизации активно растущую культуру миеломы субкультивируют замещением половины суспензии клеток свежей гибридомной средой (ГС) с 20 % ФСТ, но без 8-азагуанина.

Кондиционированная среда

Клетки гибридом плохо растут и  часто погибают при культивировании  в низких концентрациях, например при  субкультивировании и клонировании. Для того чтобы обеспечить их выживание  в таких условиях, применяют несколько  технологических приемов. Одним из примеров может быть добавление к культуре гибридом клеток селезенки мыши. В качестве фидеров (подкармливающих клеток) могут использоваться тимоциты или культуры перитонеальных макрофагов. Альтернативным способом культивирования клеток гибридом при их низкой концентрации является культивирование в кондиционированной среде, обеспечивающее выживание и рост гибридом даже в концентрациях, близких к 1 клетке в миллиметре.

Кондиционированная среда —  это ДМЕМ с 20 % ФСТ, в которой росли клетки миеломы в течение 2-3 циклов деления (24–36 часов). Лучшей кондиционированной средой является среда красновато-оранжевого цвета (в начале закисления).

Методика. Клетки мышиной миеломы культивируют в среде, содержащей 8-азагуанин. Для получения кондиционированной среды трехкратно с 2-дневным интервалом заменяют всю среду с 8-азагуанином на культуре миеломных клеток свежей ДМЕМ с 10% ФСТ, но без 8-азагуанина. Для получения больших объемов кондиционированной среды клетки миеломы выращивают в стеклянных матрасах емкостью 100–200 мл. Через два дня после третьей смены среда ДМЕМ с 10 % ФСТ меняется на ДМЕМ с 20 % ФСТ. Через 24–36 часов эту среду сливают; если в ней много клеток, то ее центрифугируют; для полного удаления клеток среду фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. К культуре миеломы снова добавляют ДМЕМ с 20 % ФСТ, которая снова кондиционируется через 24–36 часов. Так как при каждой смене среды часть клеток удаляется, оставшиеся клетки продолжают активно делиться. Поэтому кондиционирование можно продолжать неограниченно долго, следя за тем, чтобы миеломные клетки были здоровыми и активно делились.

Если кондиционированная среда  не требуется в течение какого-либо периода времени, клетки культивируют снова в среде с низким содержанием  сыворотки (10 %). При необходимости их вновь переводят на ДМЕМ с 20 % ФСТ. Нельзя помещать культуры, используемые для получения кондиционированной среды, в среду с 8-азагуанином.

Кондиционированную среду обычно используют свежей. Допустимо хранение короткий период при комнатной температуре или при –20 °C.

 

Приготовление культур перитонеальных макрофагов мышей

Культуры макрофагов готовят за 1-2 дня до слияния. Макрофаги служат в качестве фидеров, т.е. подкармливающих  клеток, устраняют токсичность среды, очищают культуры от клеточного детрита и обеспечивают обогащение среды ростовыми факторами, что создает наиболее благоприятные условия для роста молодых культур гибридом, образующихся после процедуры гибридизации. Макрофаги используют также в пластиках для клонирования с теми же целями.

Методика. Здоровых аутбредных (беспородных) мышей обескровливают декапитацией, поверхность тела мышей обрабатывают 70%-ным этанолом. Внутрибрюшинно каждой мыши вводят 10 мл охлажденной до +4 °C ДМЕМ без сыворотки. Стенки брюшной полости тщательно массируют. Через 5–10 мин мышей фиксируют, вновь обрабатывают 70%-ным этанолом. Брюшную стенку прокалывают стерильной инъекционной иглой и с помощью стерильного шприца аспирируют как можно больше жидкости из брюшной полости. Жидкость переносят в стерильные пенициллиновые флаконы по 10 мл, осторожно подслаивают около 1 мл ФСТ и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок отбрасывают. Осадок клеток растворяют в гибридомной среде до концентрации 50 000 клеток на миллилитр и распределяют по 50 мкл в лунки 96-луночных культуральных пластин. Макрофагов, полученных от одной мыши, обычно достаточно на 5–10 пластин.

Культуры инкубируют при 37 °C в атмосфере влажного воздуха с 5–6 % СО₂. Через 2–3 часа наблюдается прикрепление макрофагов к полистиролу и их трансформация.

Перед выполнением гибридизации культуры макрофагов тщательно проверяют  микроскопически на отсутствие контаминации. Пластины с проростом выбрасывают.

 

Процедура гибридизации

• За сутки перед слиянием активно  растущую культуру миеломы субкультивируют (1/2 часть суспензии клеток.) в свежей гибридомной среде с 20 % ФСТ, но без 8-азагуанина. При этом через 24 часа культура будет находиться в логарифмической фазе роста. На каждую мышиную селезенку необходимо около 20 млн клеток миеломы (в пределах 50 мл культуры).

• В день слияния проверяют культуры мышиных перитонеальных макрофагов на контаминацию.

• Все необходимые среды и 0,83%-ный  хлорид аммония помещают в водяной  термостат (37 °C). 2 г ПЭГ-4000 растворяют в 3 мл ДМЕМ без сыворотки, нагретой до 37 °C, добавляют несколько капель 2,5%-ного раствора бикарбоната натрия для достижения уровня pH, близкого к 8, и 2-3 капли ДМСО.

• Иммунную мышь с наивысшим титром антител обескровливают декапитацией. Кровь тщательно собирают в стерильный флакон для последующего серологического исследования. Мышь фиксируют в спинном положении. При помощи стерильных инструментов вскрывают брюшную полость, захватывают селезенку, отрезают ее от сальника и переносят в чашку Петри с 1,5–2,0 мл ДМЕМ без сыворотки.

• Ополаскивают селезенку в. среде. Переносят в стерильный гомогенизатор и наливают в него 10–15 мл холодной ДМЕМ без сыворотки, затем осторожно выдавливают пульпу селезенки. Клеточную суспензию переносят в центрифужный стакан, дают суспензии отстояться в течение 5 мин. За это время крупные конгломераты клеток осядут. После этого стерильной пипеткой тщательно собирают надосадок, переносят его в другую пробирку, в которой будет проводиться слияние клеток.

• Стерильной пастеровской пипеткой осторожно подслаивают ГАТ на дно пробирки под суспензию селезеночных клеток. Завинчивают крышку и центрифугируют пробирку в течение 10 мин при 1000 об/мин. Живые клетки пройдут через сыворотку и сформируют осадок. Клеточный детрит останется в интерфазе между средой и сывороткой. Надосадок отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 5 мл 0,83%-ного раствора хлорида аммония, нагретого до 37 °C. Происходит лизис эритроцитов. Через 1–2 мин. добавляют 10–15 мл ДМЕМ с 10 % ФСТ, доливают 2 мл сыворотки и вновь центрифугируют.

• Берут 3-4 матраса с активно растущими клетками миеломы. Энергичными движениями отделяют прикрепившиеся клетки и их суспензию переносят в стерильную центрифужную пробирку с закручивающейся крышкой. Клетки центрифугируют в течение 6–10 мин при 1000 об/мин.