Иммунологические методы диагностики

• После того как клетки отцентрифугируются, надосадок отбрасывают. Сравнивают объем осадков миеломных и селезеночных клеток. На 1 клетку миеломы должно приходиться не более 10 спленоцитов.

• Ресуспендируют оба осадка в 5 мл бессывороточной ДМЕМ. Затем каждую суспензию сливают в соответствующих пропорциях в центрифужную пробирку. Смесь разбавляют бессывороточной ДМЕМ до 50 мл и центрифугируют в течение 6–10 мин при 1000 об/мин.

• Осадок клеток осушают, удаляя при  помощи пипетки всю надосадочную жидкость. Постучав по дну пробирки, разбивают осадок, добавляют в пробирку 1 мл стерильного 40%-ного раствора ПЭГ-4000, нагретого до 37 °C, и тщательно суспендируют в нем клетки. Через 60 с добавляют по каплям безсывороточной ДМЕМ, затем через 60 с еще 4 мл среды, перемешивая содержимое покачиванием пробирки. Выждав еще 60 с, впрыскивают в пробирку струей 8 мл теплой ДМЕМ.

• Через 30 мин клетки центрифугируют, надосадок отбрасывают. Осадок клеток растворяют в теплой гибридомной  среде с 20 % ФСТ (или ГС) до конечного объема 50–100 мл и концентрации селезеночных клеток 10 на мл. Конечную суспензию распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты с 1–2-дневными культурами мышиных перитонеальных макрофагов. Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37 °С и 5 % СО₂.

• На следующий день добавляют  в каждую лунку по 100 мкл ГС с 2-кратной концентрацией ГAT. Проверяют планшеты на контаминацию. В первые 2 недели культивирования используют ГАТ-среду, затем 1–2 недели используют среду ГТ и в последующем — ГС с 20–15 % ФСТ. Сменять необходимо только половину среды, так как 100%-ная свежая среда губительна для многих гибридом.

Микроскопические колонии гибридом можно заменить на 4–8-й день после  слияния. При просматривании колоний  снизу белые колонии гибридом будут заметны через 10 дней после гибридизации. Так как антителопродуцирующие клетки могут быть смешаны с непродуцирующими, необходимо немедленное их клонирование сразу же после установления продукции специфических антител.

Рост и субкультивирование гибридом

Гибридные клетки, растущие в ГАТ, через 7–12 дней формируют в лунках микроскопически различимые колонии. Количество их в планшетах может быть различным, что зависит от посадочной концентрации клеток, эффективности гибридизации.

Первые 5–7 дней среду в планшетах не меняют. В дальнейшем 2-3 раза в неделю производят замену 1/2–1/3 части культуральной среды на свежую ГАТ-среду с 20 % ФСТ. Большинство колоний гибридных клеток хорошо растут, активно истощают среду и требуют более частой ее смены, чем плохо растущие колонии. Культуры с плохим ростом требуют более осторожного обращения, беспокоить их необходимо как можно меньше и добавлять только 2-3 капли свежей среды в неделю.

Скрининг. На 14–21-й день, когда большинство колоний начнут активно расти (о чем судят по быстрому закислению среды культивирования), необходимо проводить тестирование гибридомных супернатантов на присутствие антител. Общепринятым методом скринирования гибридомных культур на специфическую активность является непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Метод лишен многих недостатков, характерных для тестов вирусной нейтрализации, иммунодиффузии, РСК, РЗГА, ИМФА и др., поскольку основан на обнаружении просто специфического взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последующего взаимодействия. Так как некоторые гибридомы продуцируют низкие титры антител при культивировании в среде с пониженным содержанием сыворотки, необходимо первые две недели использовать среду, содержащую 20 % ФСТ.

После тестирования отмечают те лунки  пластин, культуральная среда в  которых содержала антитела к антигенам вируса. Большинство положительно реагирующих лунок будут содержать гибридные клетки. Присутствие антител в культуральной жидкости небольшой части прореагировавших лунок, не содержащих гибридных клонов, объясняется наличием в них фрагментов селезенки, в которых антителопродуцирующие спленоциты некоторое время сохраняют свою жизнеспособность, поэтому через 5–6 дней проводят повторное тестирование. Обычно за это время спленоциты погибают и положительная реакция отмечается лишь в лунках с антителопродуцирующими гибридами.

После тестирования проводят субкультивирование клонов из положительно прореагировавших лунок. Для субкультивирования используют 96-луночные культуральные планшеты с 1–2-дневными культурами перитонеальных макрофагов. В каждую лунку переносят по одному клону из положительных лунок исходных планшет. Через 3–5 дней культивирования пересаженных клонов их жизнеспособность проверяют в инвертированном микроскопе и вновь тестируют гибридомные супернатанты на присутствие антител. Так как неклонированные гибридомы часто теряют способность продуцировать антитела, их необходимо как можно раньше клонировать.

После клонирования гибридомы наращивают для замораживания, а также для  получения содержащей моноклональные антитела культуральной жидкости. Для этого клоны с наиболее интенсивной продукцией выращиваются в лунках 96-луночной планшетах до образования почти сплошного монослоя, после чего каждый клон переносится в отдельную лунку 24-луночной пластины с фидерными клетками. К этому времени среду ГАТ заменяют на ГТ, не содержащей аминоптерина. Через 2-3 дня, когда эти культуры подрастут и покроют около 70% поверхности роста, их делят в две другие группы и т.д., наращивая каждый клон до необходимого количества клеток. Культуры гибридом, находящиеся в стадии логарифмического роста, криоконсервируют. Часть клеток, оставшихся после криоконсервации клонов, вновь интенсивно выращивают в ГС, содержащей 20 % ФСТ, до образования сплошного монослоя. Для получения моноклональных антител с целью предварительного исследования их характеристик среду в лунках не меняют 4–5 дней. Когда среда пожелтеет, но клетки еще сохраняют жизнеспособность, ее отбирают, центрифугируют и хранят в стерильных флаконах при –4 °C. При необходимости культуральную жидкость замораживают и хранят при –70 °C.

Для получения моноклональных антител  в высоких концентрациях гибридомы  вводят в брюшную полость обработанных пристаном мышам линии BALB/c с целью индукции асцитных опухолей.

Если в контрольной ампуле криоконсервированных после восстановления 70–90 % клеток останутся жизнеспособными и не утратят способности секретировать антитела, дальнейшее культивирование гибридомной культуры прекращают.

 

Клонирование  гибридом

 

Гибридомы, как правило, не являются стабильными клеточными линиями  и имеют тенденцию к потере хромосом, что часто приводит к потере антителопродукции. Клетки, потерявшие способность секретировать антитела, приобретают способность к более активному росту и могут перерастать медленно растущие клетки, сохранившие продукцию антител. Обычно уровень антител в культуральной жидкости в это время еще достаточно высок и хорошо улавливается в ELISA. Это может привести к безвозвратной потере многих полезных клонов. Для предотвращения подобных потерь предпринимают как можно более раннее клонирование гибридом, выделяя из смеси продуцирующих и непродуцирующих клеток те, которые сохранили продукцию антител. Клонирование необходимо проводить сразу же после того, как установлена специфичность секретируемых гибридомой антител к вирусу. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне необходимо в дальнейшем проводить клонирование не реже одного раза в три месяца при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии.

Наиболее распространенным методом  клонирования является клонирование в  полужидком агаре.

Методика

1. За 2–3 дня до клонирования в одном или нескольких 12-луночных планшетах готовят культуры перитонеальных макрофагов мышей. В каждую лунку пластины вносят по 0,5 мл ГС с 20 % ФСТ, содержащей 10⁴ клеток перитонеального экссудата в 1 мл.

2. За день до клонирования  необходимо заменить половину среды в культуре свежей ГС с 20 % ФСТ. В день клонирования на водяной бане разогревают 3%-ный агар Дифко. Расплавленный агар охлаждают до 42 °C. Из лунок пластин с культурами макрофагов отбирают кондиционированную среду и смешивают с равным объемом свежей ГС, содержащей 20 % ФСТ и подогретой до 42 °C. По 10 мл этой смеси вносят во флаконы с расплавленным агаром. Приготовленный 0,5%-ный агар (половину) распределяют по лункам пластин. После застывания агара вносят по 9-10 капель ГС с 20 % ФСТ и в ней суспендируют 20–40 гибридных клеток того клона, который необходимо клонировать. Затем осторожными круговыми движениями пластины перемешивают среду над агаром и добавляют к ней равный объем жидкого 0,5%-ного агара из водяной бани. После повторного легкого взбалтывания ее помещают в холодильник (+4 °C) на 2-3 мин, а затем в СО₂-инкубатор.

3. Активный рост клонов в агаре  начинается на 3–4-й день. Когда  клоны достигают нужных размеров, их пересаживают из агара в  96-луночные планшеты с 1–2-суточными культурами макрофагов. Желательно в каждую лунку добавить по 50 мкл кондиционированной среды. Пластины с пересаженными клонами инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 2–3 дней. Затем проводят подкормку клеток, внося в каждую лунку с растущими клонами по 50 мкл свежей ГС с 20 % ФСТ. На 5–7-й день клоны тестируют на продукцию ими антител. Их наращивают и замораживают.

 

 

Определение класса и подкласса гибридомных антител

 

После клонирования гибридом проводят определение класса и подкласса секретируемых ими иммуноглобулинов. Это позволяет, во-первых, подтвердить моноклональную природу иммуноглобулинов, так как клетки одного клона должны секретировать антитела только одного класса и подкласса; во-вторых, сделать предварительное заключение о возможности дальнейшего использования антител каждого клона (так, для диагностики предпочтительны антитела класса G, не дающие, в отличие от IgM, неспецифических реакций); в-третьих, выбрать оптимальный метод очистки антител того или иного клона (солевая преципитация, аффинная хроматография и др.).

Обычно класс и подкласс гибридомных антител определяют в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони с использованием коммерческих моноспецифических кроличьих или овечьих антимышиных сывороток. При этом часто образуются слабые линии преципитации, различимые лишь при сильном боковом освещении.

Получение асцитов у  мышей

Гибридомы, культивируемые in vitro, секретируют от 0,1 до 10 мкг антител на 1 мл культуральной среды. Эти же гибридомы при выращивании в брюшной полости сингенных мышей могут вырабатывать от 1 до 10 мг на 1 мл асцитической жидкости. Оба метода получения моноклональных антител имеют свои преимущества и свои недостатки. Антитела, секретируемые in vitro хорошо отклонированной гибридомой, растущей в бессывороточной среде или в среде с ФСТ, лишенной иммуноглобулинов, являются в прямом смысле моноклональными и моноспецифичными. Недостатком является низкая концентрация их в культуральной жидкости. В том случае, когда требуются высокие концентрации антител, обычно выращивают гибридомы в виде асцитических опухолей, что практически всегда позволяет без сложностей получить необходимые их количества. Однако моноклональные антитела в асцитических жидкостях будут контаминированы иммуноглобулинами, присутствующими в нормальной сыворотке мышей. Поэтому для получения асцитической жидкости необходимо использовать мышей, не вступавших в контакт с антигенами, применявшимися для получения MA, a также с антигенами, которые могут перекрестно реагировать со специфическими.

Методика:

• Взрослым рожавшим самкам ВALB/C предварительно внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана.

• На 7–21-й день им вводятся внутрибрюшинно 1–2×10⁶ быстрорастущих, малопассированных клонированных гибридомных клеток, предварительно отмытых бессывороточной ДМЕМ.

• Асциты развиваются на 7–14-й день. Гибридомы имеют тенденцию расти в виде твердой опухоли и продуцировать низкие уровни антител. В этом случае мышь часто погибает до образования асцитов. Для того чтобы вызвать асцит, необходимо использовать более низкую дозу гибридомных клеток и новую партию мышей.

• Асцитическую жидкость собирают в  пенициллиновые флаконы, прокалывая брюшную  стенку мыши стерильной иглой.

• Асцитическую жидкость центрифугируют 6–10 мин при 1000 об/мин для удаления клеток. Все жидкости, полученные от одинаковых клонов, объединяют. Хранят их замороженными при –70 °C, или при +4 °C в преципитированном состоянии.

• Осадок клеток асцитической жидкости обрабатывают 0,83%-ным раствором хлорида  аммония, подогретым до 37 °C, подслаивают 1–2 мл сыворотки и центрифугируют. Надосадок отбрасывают, а осевшие клетки гибридом или криоконсервируют, или вводят внутрибрюшинно новой партии мышей (по 1–2 млн клеток на мышь) с целью получения асцитов.

 

 

Применение  моноклональных антител (МКА)

 

1. Получение большого количества, высокоаффинных антител, специфических по отношению к антигенам гистосовместимости.

2. Получение антител  к «биологическим молекулам».

3. Связывание и выделение в  чистом виде антигенов микроорганизмов.  МКА позволяют получать высокоочищенные  препараты, свободные от вредных  побочных примесей, с помощью их удается получать антигены вирусов герпеса, цитомегаловируса, бактерий и др.

4. Местная лекарственная терапия болезней внутренних органов, т.е. применение МКА в качестве доставки лекарственных средств к пораженному участку организма. Этот метод позволит лечить не только инфекционные болезни, но и раковые опухоли, которые могут разрушаться под действием лекарственных препаратов.

5. Использование МКА для диагностики,  а также в анализе эмбрионального  развития.