Иммунологические методы диагностики

После встряхивания пробирки помещают в термостат при температуре 37 °C на 30 мин – 1 час или выдерживают при комнатной температуре (18 °C) либо при температуре 4 °C (в зависимости от задач исследователя). После инкубации проводится оценка реакции без предварительного центрифугирования по форме осадка или после центрифугирования (при 1500 об/мин в течение одной минуты) по характеру сгустка. Для более точного учета реакции используют агглютиноскоп или просматривают под малым увеличением микроскопа или лупой. Оценка интенсивности агглютинации проводится по следующей схеме.

Резко выраженная агглютинация (++++). При встряхивании комочек эритроцитов не разбивается, жидкость совершенно прозрачна. Под микроскопом все поле зрения занято одним агглютинатом.

Умеренная агглютинация (++). Осадок при встряхивании разбивается на несколько отдельных комочков, небольшая часть эритроцитов находится в свободном состоянии и хорошо выявляется под микроскопом.

Слабая агглютинация (+). Агглютинаты мелкие, большая часть эритроцитов взвешена в жидкости. Под микроскопом на фоне отдельных эритроцитов видны небольшие агглютинаты.

Отрицательная реакция (–). Гомогенная мутная взвесь эритроцитов в жидкости, под микроскопом склеенные эритроциты не выявляются.

Наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается агглютинация эритроцитов, принимается  за титр агглютининов.

 

 

Реакция агглютинации при бактериальных инфекциях

 

Реакция агглютинации в инфекционной иммунологии широко применяется  для диагностики различных инфекционных заболеваний, для идентификации микроорганизмов, выделенных от больных и бактерионосителей.

Реакция агглютинации применяется  для решения вопросов диагностики  в двух аспектах: 1) диагностика заболевания  путем обнаружения в крови больного антител к соответствующему виду микроба; 2) идентификация микроба, выделенного из организма больного или из внешней среды с помощью известной агглютинирующей сыворотки.

Для постановки реакции агглютинации необходимы три основных компонента: сыворотка, антиген (диагностикум) и физиологический раствор натрия хлорида. В качестве антигена чаще всего применяют готовые диагностикумы, которые представляют собой микробов, убитых тем или иным способом, в виде взвеси определенной концентрации или в высушенном состоянии. Антигеном может также служить взвесь, приготовленная из любой лабораторной культуры микробов, при условии сохранения ими типичных свойств и отсутствия спонтанной агглютинации в физиологическом растворе.

Достоверными можно считать  результаты реакции только при хороших четких контролях. За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на ++.

 

 

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

 

РНГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Эта реакция специфична, и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител в зависимости от цели исследования (рис. 7).

 

 

Рис. 7. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации:

1 — эритроциты; 2 —антиген  эритроцита; 3 — конъюгированный  антиген; 4 — антитело

 

 

В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки; наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два полюса.

 

 

Реакция гемагглютинации  и реакция торможения гемагглютинации

 

В основе реакции гемагглютинации (РГА) лежит способность эритроцитов  склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки, и используется для выбора рабочего разведения антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови.

Для постановки ориентировочной РГА  на предметное стекло наносят каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и каплю  испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1–2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов.

Для постановки РГА в развернутом  ряду в лунках полистероловых планшетов  готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25–1%-ной взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

При положительном результате РГА  исследование продолжают, определяя  тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве антисыворотки  подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования антител в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус и по одной капле 1%-ной взвеси эритроцитов.

При использовании РТГА для определения  типа вируса используют типоспецифические  сыворотки, которые добавляют к  равному объему рабочего разведения антигена. Типовую принадлежность выделенного  вируса устанавливают по специфической  иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу.

РГА и РТГА широко применяются для  диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью  обнаружения специфических антител  и для идентификации многих вирусов  по их антигенам.

 

 

Реакция пассивной гемагглютинации

 

Для определения антител к ДНК чаще используют реакцию пассивной гемагглютинации. С этой целью антиген (ДНК) вначале осаждают на эритроцитах барана, а затем добавляют к ним исследуемую сыворотку. Если в сыворотке содержатся антитела к ДНК, происходит агглютинация эритроцитов и их гемолиз. В зависимости от типа используемого антигена удается выделить несколько типов антител к ДНК: I тип — антитела к односпиральной ДНК, II тип — к термоденатурированной ДНК, III тип — к нативной двуспиральной ДНК. Определение типа антител позволяет проводить дифференциальную диагностику различных заболеваний (см. ниже).

Неполные антитела к эритроцитам  обнаруживаются при помощи прямого  и непрямого тестов Кумбса. Непрямая проба Кумбса основана на выявлении агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки.

Проба осуществляется в два этапа. Вначале проводится сенсибилизация стандартных резус-положительных  эритроцитов донора 0 (I) группы. Каплю взвеси эритроцитов вносят в пробирку, наслаивают на них несколько капель исследуемой сыворотки, в которой предполагают наличие антител к эритроцитам, и инкубируют 40 мин при 37 °C. Эритроциты осторожно отмывают от сыворотки физиологическим раствором. Неполные антитела, если они присутствуют в исследуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах, но не могут вызвать их агглютинацию (рис. 8).

 

 

Рис. 8. Схема проведения непрямой пробы Кумбса:

а, б — соответственно первый и второй этапы исследования

 

 

На втором этапе пробы на сухую тарелку наносят каплю стандартной антиглобулиновой сыворотки, содержащей антитела к человеческим иммуноглобулинам, и добавляют туда эритроциты, на которых предположительно фиксированы неполные антитела исследуемой сыворотки. Если на предыдущем этапе исследования на поверхности эритроцитов действительно фиксировались противоэритроцитарные антитела, последние взаимодействуют с антителами к иммуноглобулину стандартной антисыворотки (см. рис. 8). В результате происходит агглютинация (склеивание) эритроцитов.

При прямой реакции Кумбса используют собственные эритроциты пациента, которые предположительно уже были сенсибилизированы аутоантителами. Эритроциты добавляют в антиглобулиновую сыворотку: при наличии на их поверхности фиксированных иммуноглобулинов (антител к эритроцитам) возникает агглютинация эритроцитов.

Аутоантитела к эритроцитам  обнаруживают при аутоиммунных гемолитических анемиях, гемолитической болезни новорожденных, системных заболеваниях соединительной ткани, хроническом активном гепатите и других заболеваниях.

 

 

 

Реакция преципитации

 

В основе механизма этой реакции  лежит выпадение из раствора нерастворимого комплекса антиген-антитело. Реакция  преципитации позволяет обнаруживать ничтожные количества белкового  антигена (до разведения 1:1 000 000). Она в этом отношении чувствительнее многих химических реакций, хотя в свою очередь уступает по чувствительности реакции связывания комплемента и анафилаксии. Реакция преципитации нашла широкое применение для определения степени родства видов животных и растений.

Реакция преципитации основана на взаимодействии антигенов и антител в эквивалентных  количествах. Кольцепреципитация —  появление непрозрачного кольца преципитата при постепенном  наслаивании растворимого антигена на иммунную сыворотку. Например, для определения антигенов сибирской язвы используют сыворотку крови иммунизированных лошадей, при этом кольцо преципитата появляется в течение 2 мин. Также эту реакцию можно проводить на твердых средах (агаре). При этом в два углубления среды помещаются сыворотка и взвесь бактерий, зона преципитации образуется между ними. Эти реакции используются для определения антигенов бактерий, тканей человека и животных, диагностики некоторых инфекционных заболеваний, определения видовой принадлежности белка в судебной медицине.

Феномен преципитации заключается  во взаимодействии мелкодисперсных  антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 9). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде — по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.

 

 

Рис. 9. Реакция преципитации:

1 — антиген; 2 — антитело

 

 

 

 

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони

 

Для постановки реакции используют 1%-ный агар Дифко, который разливают  расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую — иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно — через 24–48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 10, б).

 

 

Рис. 10. Реакция преципитации:

а — реакция кольцепреципитации; б — реакция преципитации по Оухтерлони

 

 

 

 

Реакция кольцепреципитации

 

Данную реакцию применяют для  выявления антигенов с помощью  иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1–0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3–5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 10, а). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител.

 

 

 

Метод радиальной иммунодиффузии

 

Принцип наиболее простого и распространенного метода радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле антигена (в данном случае иммуноглобулина исследуемой сыворотки) и антитела (антител к иммуноглобулинам человека, содержащимся в стандартных антисыворотках).

Стандартные антисыворотки с антителами к IgG, IgM, IgA смешивают с расплавленным  агаром. Эту смесь заливают на специальные  пластины. После ее застывания на каждой пластине специальным пробойником  делают 35 лунок диаметром 2 мм (рис. 11, а). В лунки микропипеткой вносят по 2 мкл последовательных разведений (1:1, 1:2, ... 1:8) стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов, а также такое же количество разведений исследуемой сыворотки (с неизвестным содержанием иммуноглобулинов).

 

 

Рис. 11. Схема определения  концентрации иммуноглобулинов методом  радиальной иммунодиффузии:

а — внесение стандартной  и исследуемой сыворотки в  лунки пластины с залитым агаром, содержащим антитела к иммуноглобулинам; б — фрагмент пластины после инкубации (видны кольца преципитации, диаметр которых зависит от концентрации иммуноглобулинов); в — калибровочная кривая зависимости диаметра колец преципитации от концентрации иммуноглобулинов стандартной сыворотки