Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

СОДЕРЖАНИЕ

Введение 8

1 Общая часть 10

1.1 Краткая характеристика флавоноидов 10

1.2 Подготовка  растительного сырья, идентификация,  выделение и разделение флавоноидов 14

1.2.1 Сушка  растительного сырья 14

1.2.2 Первичное  исследование растительного сырья 15

1.2.3 Экстрагирование  флавоноидов из растительного  сырья 17

1.2.4 Хроматографические  методы идентификации флавоноидов 18

1.2.4.1 Тонкослойная  хроматография 18

1.2.4.2 Высокоэффективная  жидкостная хроматография 20

1.3 Количественное  и качественное определение флавоноидов 22

1.3.1 Химические  методы исследования флавоноидов 22

1.3.1.1 Методы  качественной идентификации флавоноидов 22

1.3.1.2 Объемные методы количественного определения флавоноидов 26

1.3.2  Электрохимические  методы исследования флавоноидов 26

1.3.2.1 Потенциометрический  метод количественного определения  флавоноидов 26

1.3.2.2 Полярографические  методы количественного определения  флавоноидов 27

1.3.2.3 Метод  капиллярного электрофореза 27

1.3.3 Физико-химические  методы исследования флавоноидов 31

1.3.3.1 Оптические  методы определения флавоноидов 31

1.3.3.2 Абсорбционная  спектроскопия 34

1.3.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов 45

1.3.4.1  Хроматомасспектрометрическое  определение флавоноидов 45

2 Специальная часть 50

2.1 Выбор объекта  исследования 50

2.1.1 Характеристика  исследуемого сырья 50

2.1.1.1 Цветки  календулы 50

2.1.1.2 Трава пустырника 51

2.1.1.3 Плоды  боярышника 51

2.2 Методики  экспериментов и анализов 52

2.2.1 Методы  отбора проб 52

2.2.2 Метод  определения влажности лекарственного  растительного сырья 53

2.2.3 Методика  количественного определения суммы  флавоноидов в растительном сырье  спектрофотометрическим методом 54

2.2.4 Количественное  определение рутина и кверцетина  в лекарственном растительном  сырье методом хроматомасспектрометрии 57

2.2.5 Использованные  реагенты 60

2.3 Результаты  и обсуждение 61

2.3.1 Определение  влажности 61

2.3.2 Количественное  определение суммы флавоноидов  в растительном сырье спектрофотометрическим  методом при оптимальных условиях  экстрагирования 62

2.3.3 Количественное  определение флавоноидов в лекарственном  растительном сырье методом хроматомасспектрометрии 63

3 Экономическая часть 69

Введение 69

3.1 Определение  затрат на проведение исследования 74

3.1.1 Материальные  затраты 74

3.1.2 Затраты  на израсходованную электроэнергию 75

3.1.3 Заработная  плата исполнителей исследования 76

3.1.4 Амортизационные  отчисления 76

3.1.5 Расчет  отчислений в социальные фонды 77

3.1.6 Определение  накладных расходов 78

3.1.7 Смета  затрат 78

Заключение 79

4 Безопасность  и экологичность 80

4.1 Идентификация  опасных и вредных факторов  при работе в химической лаборатории 80

4.1.1 Основные  понятия и гигиенические требования  к производственному освещению 81

4.1.2 Влияние  вибрации на условия труда  в химической лаборатории 82

4.1.3 Влияние  шума на организм человека 82

4.1.4 Вредные  вещества в воздухе рабочей  зоны и их воздействие на  организм человека 83

4.2 Техника  безопасности при работе в  химической лаборатории 85

4.2.1 Общие требования безопасности при работе в лаборатории 85

4.2.2 Требования охраны труда перед началом работы 86

4.2.3 Требования охраны труда во время работы 86

4.2.4 Требования охраны труда по окончании работы 88

4.3 Общие положения  по технике безопасности при  использовании электроустановок  в лаборатории 89

4.4 Эксплуатация  электроприборов 89

4.5 Требования  охраны труда в аварийных ситуациях 90

4.5.1 Общие  требования безопасности в аварийных  ситуациях 90

4.5.2 Требования  безопасности в аварийных ситуациях  при использовании электроустановок  в лаборатории 91

4.5.3 Первая  помощь пострадавшим от электрического  тока 91

4.5.4 Требования  безопасности в аварийных ситуациях  при возникновении пожара в  лаборатории 92

4.5.5 Действия  по оказанию первой помощи  пострадавшим 93

4.6 Экологичность  эксперимента 94

4.7  Расчет  осветительной установки для  учебно-аналитической лаборатории 95

Заключение 100

Список использованных источников 101

ВВЕДЕНИЕ

 

Лекарственные средства растительного  происхождения нашли широкое  применение в современной фармакотерапии. К ним относят как химически  чистые вещества и комплексы веществ, так и настойки, эликсиры, бальзамы и др. Одним из важнейших классов действующих соединений, содержащихся в лекарственном растительном сырье, являются флавоноиды.

Флавоноиды представляют собой многочисленной класс природных  соединений, многообразие которых обуславливается, главным образом, строением агликона (степенью окисленности трехуглеродного фрагмента, положением бокового фенильного радикала, величиной гетероцикла и других признаках), а также составом гликозидного фрагмента.

Интерес к флавоноидам  велик ввиду присущего им широкого спектра биологического действия и  антиоксидантной активности. В современной  науке огромное внимание уделяется  поиску оптимальных путей использования  флавоноидов в интересах укрепления здоровья людей, профилактики и лечения  различных патологий, вызванных  или сопровождающихся усилением свободнорадикальных процессов окисления.

В настоящее время для  идентификации и количественного  определения флавоноидов в лекарственных  средствах широко используются физико-химические методы анализа, такие как спекрофотометрия, абсорбционная спектроскопия. Однако все большее распространение получают комбинированные методы, включающие различные варианты хроматографического разделения исследуемых компонентов. Широкое распространение физико-химических и комбинированных методов анализа, в первую очередь, связано с тем, что эти методы обладают значительно большей чувствительностью и селективностью по сравнению с современными химическими и электрохимическими методами.

Целью дипломной работы является разработка методики качественного  и количественного анализа природных  флавоноидов (рутина и кверцетина) с  использованием спектрофотометрического  и хроматомасспектрометрического методов.

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих  задач:

1. выявить необходимость качественного и количественного анализа биофлавоноидов;
2. выявить особенности (строение, физические и химические свойства) природных флавоноидов как объектов исследования;
3. проанализировать содержание рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье;
4. изучить современные методы выделения и идентификации флавоноидов;
5. изучить теоретические вопросы анализа методами спектрофотометрии и хроматомасспектрометрии;
6. определить оптимальные условия экстрагирования рутина и кверцетина из выбранного растительного сырья;
7. провести количественное и качественное определение флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим и хроматомасспектрометрическим методами;
8. сделать выводы об эффективности использованных методов определения рутина и кверцетина.

 

1 ОБЩАЯ ЧАСТЬ

1.1 Краткая характеристика флавоноидов

 

Флавоноидами называется группа природных биологически активных веществ (БАВ) – производных бензо-γ-пирона (рисунок 1.1), в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С₆-С₃-С₆ углеродных единиц. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце [1].

 

 

Рисунок 1.1 – Структура  бензо-γ-пирона

 

При замещении в хромоне атома водорода в α-положении на фенильную группу образуется 2-фенил-(α)-бензо-γ-пирон или флавон (рисунок 1.2), который состоит из 2 ароматических остатков А и В и трехуглеродного звена (пропановый скелет)

 

 

Рисунок 1.2 – Структура  флавона

 

В зависимости от степени  окисления и гидроксилирования пропанового скелета С₆-С₃-С₆ и положения фенильного радикала флавоноиды делятся на несколько групп  
(схема 1.1) [2].

 

 

 

 

              

                                  

 

Схема 1.1 – Классификация  флавоноидов

 

Флавоны – органические соединения гетероциклического ряда, фенильная группа находится во 2-м положении. Содержатся в цветках пижмы, ромашки.

Изофлавоны – фенильная группа находится в 3-м положении. Содержатся в корнях стальника полевого.

Флавонолы – отличаются от флавонов наличием группы ОН в 3-м положении, наиболее распространенными представителями являются кверцетин, кемпферол. У высших растений особенно часто встречается кверцетин, у однодольных преобладают производные кемпферола.

Флавононы – гидрированное производное флавона, в отличие от флавона не имеют двойной связи между углеродами во 2-м и 3-м положениях.  Известно свыше 30 представителей этой группы флавоноидов. Они обнаружены в семействах Rosaceae, Fabaceae и Asteraceae.

Флавононолы отличаются от флавонола отсутствием двойной связи между углеродами во 2-м и 3-м положениях. ОН-группа, как и у флавонола, находится в 3-м положении. Скелет флавонола составляет гликозид аромадендрин, содержащийся в листьях эвкалипта.

Флавоноиды, которые связаны  с одной или более молекулой сахара называют гликозидами флавоноидов. Гликозиды – это сложные безазотистые органические соединения, при гидролизе распадающиеся на сахаристую часть – гликон и  
несахаристую – агликон или генин. Большинство из флавоноидов находятся в клетках в виде гликозидов (О-гликозидов – основная группа и С-гликозидов (гликофлавоноиды)) или находятся в виде соединений с органическими кислотами [3].

По физическим свойствам  флавоноиды являются кристаллическими веществами с определенной температурой плавления, без запаха, имеющие жёлтый цвет (флавоны, флавонолы), бесцветные (изофлавоны, флаваноны). К группе флавоноидов относятся также антоцианы (природные красящие вещества растений), которые окрашиваются по-разному в зависимости от ρН среды: в кислой среде они имеют красный цвет (соли катионов), в щелочной – синий (соли анионов).

Агликоны флавоноидов, как правило, растворимы в ацетоне, спиртах, органических растворителях и нерастворимы в воде. Гликозиды плохо растворимы в воде, за исключением гликозидов, имеющих в своей молекуле более трёх остатков сахара, не растворимы в органических растворителях (эфире и хлороформе).

Флавоноидные гликозиды  обладают оптической активностью, для  них характерна способность к  кислотному и ферментативному гидролизу. Скорость гидролиза и условия  его проведения различны для различных  групп флавоноидов.

По химическим свойствам  О-гликозиды (цианогенные гликозиды, агликоновый компонент которых образован из α-циангидринов) при действии разбавленных минеральных кислот и ферментов легко гидролизуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозиды с трудом  расщепляются под действием концентрированных кислот (HCI или СН₃СООН) или их смесей при длительном нагревании.

 Примерами флавоноидов,  значимых для человека являются  рутин и квертецин [4].

Рутин – органическое соединение из группы флавоноидов, обладающее витаминной активностью. По химической структуре рутин представляет собой 5,7,3’,4’-OH-3-рамноглюкозид (рисунок 1.3) [3,5].

 

 

Рисунок 1.3 – Химическая структура рутина

 

Основные функции рутина: антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные, антитромбические, противоязвенные, антиаллергические, противоотечные, спазмолитические, сахароснижающие, желчегонное действие; коррекция микроциркуляции крови и лимфы; укрепление стенок капилляров, защита от кровоизлияний; уменьшение венозного отека; сдерживание агрегации тромбоцитов; защита от токсинов; увеличение плотности костной ткани; ингибирование альдолазы, трансминазы, С – реактивного белка; ингибирование перекисного окисления липидов; увеличение активности адреналина; снижение активности щитовидной железы.

В организме человека рутин  не вырабатывается. К основным природным источникам рутина относятся: листья гречихи, листья чайного куста, черная смородина, шиповник, клюква, соки черники и рябины, можжевельник (ягоды), боярышник (бутоны), ромашка (цветы), календула [2,3].

Кверцетин (рисунок 1.4) является агликоном рутина. По химической структуре кверцетин представляет собой 3,5,7,3'4'-Пентаоксифлавон [3,5].

 

 

Рисунок 1.4 – Химическая структура кверцетина

 

К основным функциям кверцетина относится: антиоксидантное, противоотечное, спазмолитическое, антигистаминное, противовоспали-тельное, диуретическое, противоязвенное,  гипотензивное, иммуностимулирующее, противодиабетическое, гипогликемическое, противовирусное, ранозаживляющее, геропротекторное, анаболическое действия; снижение проницаемости стенок капилляров; повышение тонуса сосудов; блокада синтеза лейкотриенов и других воспалительных медиаторов; процессы ремоделирования костной ткани; эстрогено-подобное действие; нормализация выработки кортизона и инсулина; защита ЛНП-холестерина от окисления; улучшение реологии крови; угнетение синтеза тромбоксана; поддержка миокарда; стабилизация клеточных мембран; стимуляция ферментных систем; улучшение функций фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов; транспорт калия и натрия; адаптация к гипоксии; апоптоз раковых клеток.